CRISPR/Cas9是一种强大的基因组编辑工具，表现出有效纠正致病突变的潜力。近期，宾夕法尼亚大学Perelman医学院的研究人员，首次开发出一种双基因治疗方法，将一个CRISPR/Cas9介导的基因打靶系统的关键部件，传递到小鼠体内来血友病B。这种疾病又称第九因子缺乏症，是由一个缺失的或损坏的凝血蛋白导致的。他们的这项研究将提交到12月3日到6日举行的第五十八届美国血液学会会议。

大多数单基因疾病，如血友病，是由于分散在一个特定基因中的不同突变引起的，而不是一个单一的主要突变，所以该团队需要开发一个载体，适用于携带任何突变的患者。本研究是利用一种通用CRISPR/Cas9基因打靶方法的临床前概念验证研究，可以适用于大多数的特定疾病患者，在这种情况下，是指血友病B。根据疾病控制和预防中心资料显示，血友病在活产儿中的一般发生率是1/5000，在美国大约有20000人患血友病。

本研究第一作者、宾州大学基因治疗项目（GTP）的副教授王丽丽（音译，Lili Wang）博士说“基本上，我们能治愈小鼠。”医学教授、GTP主任James M Wilson博士，是这项研究的资深作者。王丽丽博士早年毕业于复旦大学，1996年博士毕业于美国罗格斯大学。

为了验证这种新方法，该研究小组在一种小鼠模型中进行了实验，这些小鼠的凝血因子IX被敲除。他们用一种双载体的方法，表达SaCas9基因的载体1，是由一个肝脏特异性启动子驱动，这就使得基因编辑机器能够到达肝脏——产生凝血因子IX的自然场所。载体2使得这项研究不同于以前在宾夕法尼亚大学Gene Therapy项目中的CRISPR基因治疗研究。载体2含有一段RNA序列，可特异性地靶定小鼠凝血因子IX基因外显子2 的5端的一个区域，以及一部分人凝血因子IX cDNA序列，从而使得这种方法更加高效、准确。

该研究小组使用腺相关病毒载体，将这些组件传递给小鼠肝细胞。他们开发的策略是基于CRISPR介导的同源重组，将人类cDA插入小鼠基因组中的因子IX部位。

王博士说：“有针对性的插入，可导致嵌合多动因子IX蛋白在原生小鼠IX因子启动子的控制下表达。”

向新生和成年敲除小鼠体内注射递增剂量的两个载体，超过4个月的时间，表现出稳定的因子IX活性，达到或高于正常水平。在载体治疗八周后，一小部分新生的和成年基因敲除小鼠接受了部分肝切除手术，并且它们全部成活，而没有任何并发症或干预，并持续表达相同水平的凝血因子IX。

王博士说：“这项研究提供了令人信服的证据证明，体内CRISPR/Cas9基因组编辑在血友病B小鼠模型中具有很好的疗效。”Wilson实验室的访问学者Yang Yang博士，以及来自宾夕法尼亚大学的John White、McMenamin Deirdre和Peter Bell，都是本文共同作者。

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