(一)材料与方法

1．实验动物

昆明种雄性小鼠250只，体重25+1g，由上海斯莱克实验动物有限公司提供，动物生产许可证号：SCXK(沪)2003-0003。

2．瘤源

H22肝癌腹水瘤株，冷冻保存于课题组实验室－80℃冰箱。

3．主要仪器

MP2002电子天平，数字WMY-01型温度计，SQF-EA体视显微镜，3200K(色温)、250W摄像专用光源及自制光源装置，Nikon Coolpix 4500数码相机，底部划有4.5cm×5.5cm方格(3行×6列＝18格)的实验笼用于旷场检测，YLS-13A型小鼠抓力测定仪，游标卡尺。

4．造模方法

(1)细胞复苏及培养

1)从－80℃冰箱中取出含1.5ml H22腹水瘤细胞的冻存管。

2)迅速将冻存管投入到已经预热的37℃水浴锅中迅速解冻，并不断的摇动，使管中的液体迅速融化；约1～2min后冻存管内液体完全溶解，取出用乙醇棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。

3)1500r/min离心3min。

4)弃去上清液。

5)向离心管内加入5ml的PBL培养液，吹打制成细胞悬液。

6)细胞计数，浓度以5×100000/ml为宜。

7)培养细胞，将细胞悬液分装入培养瓶内，将培养瓶放入含5％CO2的37℃培养箱内培养24h，观察后换液继续培养，换液的时间由细胞倍增情况而定。

8)待体外培养3代后，离心收集细胞，并予以细胞计数。

(2)小鼠体内传代

取3只正常昆明种小鼠作为种鼠，每只腹腔内注射0.3ml的H22肝癌细胞。1周后待腹水长出后，无菌条件下抽取淡黄色腹水，再抽取0.5ml在正常小鼠体内传代，如此共传5代。取第5代种鼠数只，抽取腹水后，用0.9％生理盐水调整细胞浓度为1×10000000/ml。

(3)H22肝癌荷瘤昆明种小鼠模型的建立

在实验动物中心，75％乙醇常规消毒小鼠右腋部，皮下注射0.2ml细胞液(含细胞数为2×1000000个)。每只接种前，充分摇匀细胞液，在60min内接种完毕。

5．指标检测

(1)四诊指标检测

检测体重、摄食量、饮水量、抓力、旷场水平跨格(跨格数)和垂直站立(前肢离地站立数)、腋温、爪和尾显微拍照及图像处理，以及一般情况观察如动物恢复及死亡情况等。第7日(接种肿瘤细胞第7日)、16日(接种肿瘤细胞第16日)、25日(接种肿瘤细胞第25臼)各检测1次，共3次。

(2)特殊指标检测

按照公式计算：①瘤体积＝0.5×(最长直径×最短横径2)，单位为cm3。②去瘤体重＝带瘤体重－(瘤体积×1)。

6．数据处理

建立原始检测数据库，不同日期的检测插入新表，形成完整证候演变档案；求出各指标正常对照组均值，各指标、各组内、各动物的实测值/正常对照组均值(如体重/正常组均值)；对所求出的值作计量化的辨证处理，并计算各指标/正常对照组均值、各证候程度的组内均数，作图并分析。计量化辨证标准如下：

(1)气虚程度

气虚程度＝（各动物水平/正常组均数）×0.3＋（各动物直立/正常组均数）×0.2＋（各动物抓力/正常组均数）×0.5

辨证标准：与正常组比较，＞1.5为气盛，＜0.75为气虚，＜0.5为气虚甚，＜0.25为气亏。

(2)血虚程度

血虚程度＝（各动物爪r值/正常组均数）×0.6＋（各动物尾r值/正常组均数）×0.4

辨证标准：与正常组比较，＞1.1为血充盈，＜0.9为血虚，＜0.8为血虚重，＜0.7为血亏。

(3)阴虚程度

阴虚程度＝各动物去瘤体重/正常组均数

辨证标准：与正常组比较，＞1.2为形丰，＜0.85为阴虚，＜0.7为阴亏，＜0.6为液脱。

(4)阳虚程度

阳虚程度＝（各动物腋温/正常组均数）×0.3＋（各动物爪r值/正常组均数）×0.5＋（各动物尾r值/正常组均数）×0.2

辨证标准：与正常组比较，＞1.02为阳气盛，＜0.98阳虚，＜0.95阳虚重，＜0.9阳损。

剔除数据：将接种后第14日肿瘤最大直径小于1.0cm的小鼠剔除，不用于数据分析。

注：四诊指标检测和计量化辨证的具体方法参见本书第三章及所附参考文献。

7．统计分析

采用SPSS12.0统计软件，运用方差分析和t检验，P＜0.05表示在统计上具有显著性差异。

8．动物处死

(1)用于证候物质基础研究的荷瘤小鼠

①于接种后第9日，处死邪毒壅盛证、气虚证荷瘤小鼠各8只。②于接种后第18日，处死阳气虚证、气虚证荷瘤小鼠各8只，同时处死正常对照、正常气虚小鼠各8只。③于接种后第26日，处死中晚期气阴阳虚证、气虚证荷瘤小鼠各8只。

这些分批处死的小鼠将用于不同证候物质基础的实验研究。

(2)其余荷瘤小鼠

其余荷瘤小鼠于接种后第31日处死。

(二)实验结果

1．出瘤早期瘤周组织液检测

腋下接种，H22肝癌实体瘤出瘤早期，瘤周组织液检测，尚可见大小不等的肿瘤细胞，其中部分肿瘤细胞成团状，期间是散在的红细胞(图4-1-1、图4-1-2)。随着肿瘤的增长，瘤周组织液逐渐吸收，取代以实体瘤。

注：×400表示400倍显微镜下，下同。

2．正常与H22肝癌荷瘤昆明种小鼠的外观

小鼠接种H22腹水瘤细胞后，肿瘤日益增大，伴随的是其精神状态日趋萎靡、瘤体上的皮毛蓬松与脱落，步态不稳，行动不便等(图4-1-3～图4-1-6)。

注：以上各照片中的荷瘤小鼠并非是同一只小鼠的演变过程，而是通过这组照片反映不同时期荷瘤小鼠的大体证候演变情况。

3．不同阶段处死小鼠的相关情况

(1)证候情况

8只正常对照小鼠气、阴、阳的程度接近(图4-1-7)；而正常对照气虚证小鼠突出表现为气虚，阴阳的程度在正常范围，且十分接近(图4-1-8)。

在疾病发生的早期：8只邪毒壅盛证小鼠，突出表现为肿瘤增长迅速，体积远较其他荷瘤小鼠为大，而气、阴、阳的程度在正常范围(图4-1-9)；同期的气虚证荷瘤小鼠突出表现为气虚，阴阳的程度在正常范围，肿瘤大小居中，但离散度较大(图4-1-10)。

疾病发展到中期：8只阳气虚证荷瘤小鼠，肿瘤体积较大，兼气虚和阳虚(图4-1-11)；同期的气虚证荷瘤小鼠突出表现为气虚且程度严重，阴阳的程度在正常范围，肿瘤体积略大于荷瘤小鼠肿瘤的均数(图4-1-12)。

疾病发展到中晚期，8只气阴阳虚证荷瘤小鼠，出现了气虚、阴虚、阳虚，以气虚、阴虚为显著(图4-1-13)；而同期的气虚证荷瘤小鼠突出表现为气虚且程度严重，阴阳的程度在正常范围。两证候肿瘤体积略大于同期荷瘤小鼠肿瘤的均数(图4-1-14)。

(2)瘤重与肿瘤指数

3个阶段单纯的气虚证，其肿瘤体积略小于同期的虚证复合证或邪毒壅盛证(图4-1-15)，提示肿瘤小鼠虚证为因实致虚。

(注：图中的“正常”代表正常对照小鼠，“正气虚”代表正常见有气虚证小鼠，“邪毒”代表早期邪毒壅盛证荷瘤小鼠，“早气虚”代表早期气虚证荷瘤小鼠，“中气虚”代表中期气虚证荷瘤小鼠，“阳气虚”代表中期阳气虚证荷瘤小鼠，“阴虚证”代表中晚期气阴阳虚证荷瘤小鼠，“晚气虚”代表中晚期气虚证荷瘤小鼠。下同。)

(3)脾脏重量与胸腺重量

荷瘤小鼠脾重显著大于正常小鼠(P＜0.01)，总体上，随着疾病的发展重量逐步增加；早期两个证候脾重近似；中期阳气虚证大于单纯气虚证，与肿瘤大小趋势一致；而中晚期气阴阳虚证略轻于单纯气虚证，提示脾脏趋于失代偿(图4-1-16)。

中期和中晚期荷瘤小鼠胸腺显著低于正常小鼠(P＜0.01)，且随着肿瘤的发展，逐渐退化；早期近似，邪毒壅盛证略轻于同期的气虚证；中期和中晚期各自两个证候的差异不大(图4-1-17)。

总之，瘤重、脾重、胸腺重等与证候具有相关性，可以看到不同证候在这一层面的物质基础。

(4)芯片检测结果

参见另文，略。

4．其余荷瘤小鼠证候及其演变情况

将以上不同阶段处死的小鼠所有数据剔除，其余小鼠肿瘤及证候演变情况如下：

(1)不同时间存活率与瘤体积增长情况

荷瘤小鼠在疾病发生发展过程中，在接种瘤细胞第2周内，瘤体积增长趋势并非最快，但是小鼠死亡率却较高(存活率急剧下降)；而在接种瘤细胞第4周内，小鼠瘤体积增长迅速，但小鼠死亡率却并非最快(图4-1-18、图4-1-19)。

(2)体重与去瘤体重

与正常小鼠比较，荷瘤小鼠体重在接种后第7日、16日、25日均有显著性差异(P＜0.01)；而去瘤体重在正常与荷瘤小鼠三次检测中均无显著性差异(图4-1-20、图4-1-21)。

(3)腋温和抓力

小鼠腋温在不同时期检测有所波动，正常小鼠腋温多数在37.5℃～38℃之间，而荷瘤小鼠腋温总体偏低。与正常小鼠比较，荷瘤小鼠腋温在接种后第7日、16日、25日均有显著性差异(P＜0.01)，阳气受损(图4-1-22)。

    正常小鼠抓力随体重增加，抓力呈现增加趋势，而荷瘤小鼠因肿瘤增大致使抓力下降，尤其是中晚期下降显著。与正常小鼠比较，荷瘤小鼠在接种后第7日无显著性差异；而第16日、25日有显著性差异(P＜0.01)(图4-1-23)。

(4)旷场检测

小鼠旷场检测发现，在接种后第7日，此时肿瘤相对较小，与正常小鼠比较，荷瘤小鼠旷场实验跨格数无显著性变化，而前肢离地次数已减少。在接种后第16日和第25日检测发现，旷场实验跨格子数和前肢离地次数均显著下降(P＜0.01)，提示因瘤体积增大影响到自主活动，出现了气虚证候(图4-1-24、图4-1-25)。

(5)爪r值和尾r值

爪r值和尾r值是反应红色程度的客观化、定量化指标。由图4-1-26、图4-1-27可见，在不同时间，正常小鼠爪r值呈现上升趋势，尾r值呈现下降趋势；荷瘤小鼠爪r值在接种第7日和第16日与正常小鼠变化趋势一致，第25日显著下降，尾r值与正常小鼠变化趋势几乎一致。但是，在同一时间内，与正常小鼠比较，荷瘤小鼠爪r值和尾r值均显著下降(P＜0.01)，提示荷瘤小鼠随肿瘤的发展，精血虚、阳虚等在爪、尾日益显现。

(6)同病异证

进一步对编号为149和179的H22荷瘤小鼠各证候的演变进行分析(图4-1-28、图4-1-29)。No.149的荷瘤小鼠接种第7日虚证不明显，邪毒证相对弱，随着疾病的发展，邪毒证与气虚证日益加重，并伴随阴虚证和阳虚证的发生；No.179的H22肝癌小鼠接种第7日虚证亦不明显，随着疾病的发展，该小鼠邪毒证发展相对平稳，相对应的其他虚证也不显著。提示：荷瘤小鼠个体证候的演变与自身肿瘤大小密切相关。虚实夹杂证候复杂，一般邪毒证越严重、虚证也越重；相反，邪毒证轻者，各虚证也轻。