不同高脂血症造模大鼠

来源:《大鼠、小鼠辨证论治实验方法学》 发布时间:2017年02月06日 浏览次数: 【字体: 收藏 打印文章

高脂血症(Hyperlipemia)系指血浆中胆固醇(TC)或/和甘油三酯(TG)水平超过正常水平,由于血浆中的胆固醇和甘油三酯不能直接在血液中运转,必须与血液中的蛋白质结合形成脂蛋白复合物,因此本病又称为高脂蛋白血症。近年来,已逐渐认识到血浆中高密度脂蛋白-胆固醇降低也是一种血脂代谢紊乱,因而,有人建议采用脂质异常血症,并认为这一名称能更为全面准确地反映血脂代谢紊乱状态。高脂蛋白是动脉粥样硬化的主要原因,动脉粥样硬化可引起心、脑、血管疾病;另外高脂血症又可引起胆石症等疾病。流行病学调查证实,我国高脂血症的发病率在10%左右,全国超过一亿的人口需要接受调脂治疗,且患病人群越来越年轻化。

目前,中医药实验中大量使用高脂饲料喂养致高脂血症模型大鼠。但不同高脂饲料配方喂饲大鼠后,大鼠血脂代谢紊乱是否一致?是否存在特殊的证候、复合证候,以及证候是否会发生演变?如果存在,在不同造模方法又存在什么样的区别,能不能准确、定量地采集和刻画这样的特征?这对于开展高脂血症辨证论治的基础研究十分必要。对此,我们采用不同配方的高脂饲料复制两种高脂血症大鼠模型,并对其不同阶段进行四诊标准化、客观化检测,并计量辨证,观察同病异证的现象。

一、材料与方法

1.实验动物

清洁级雄性健康SD大鼠30只,体重180~220g,购自上海斯莱克实验动物有限责任公司,实验动物生产许可证号:SCXK(沪)2003-0003。每笼5只,自由饮水和摄食,明暗周期12 h,室温21±1℃,湿度50±10%。

2.实验仪器

721分光光度计,皮尺,MP1001型电子天平,数字WMY201型温度计,SQF2EA体视显微镜,3200K(色温)、250W摄像专用光源和普通光源,底部划有6.5cm×7.0cm方格的实验笼,NIKON Coolpix 4500数码相机,YLS-13A型大鼠、小鼠抓力测定仪,Photoshop7.0图像软件,SPSS 11.5统计软件。

3.饲料与试剂

    1)胆固醇、甘油三酯、血糖测定试剂盒购自上海荣盛生物技术有限公司。

    2)高脂饲料配方*:79%基础饲料、1%胆固醇、10%猪油、10%蛋黄粉。

    3)高蛋白加高脂饲料。:73%基础饲料、1%胆固醇、10%猪油、10%蛋黄粉、6%奶粉。

    *高脂饲料均委托苏州双狮实验动物饲料科技有限公司合成。

4.造模方法

30只大鼠随机分为正常组、高脂1组、高脂2组各10只。正常组给予普通饲料喂养,高脂1组和高脂2组分别喂以高脂饲料和高蛋白加高脂饲料,共6周。

5.指标检测

(1)四诊指标检测

饮水量(ml),摄食量(g),体重(g),腋温(℃),爪、尾显微拍照及图像处理,旷场水平跨格和垂直站立,抓力(g)。分别于第1日、13日、27日、40日,对以上指标进行检测,以分组时饲以不同饲料那天为实验的第1日。

(2)疾病特殊指标检测

1)于实验结束前2日,以血糖试剂盒测定各组大鼠的空腹向糖和糖负荷2h血糖。

2)动物处死前以25%乌拉坦溶液麻醉后,以皮尺测定大鼠鼻尖至肛门的长度计为体长,同时称其体重,以此体长和体重计算Lee's指数=3√体重(g)×1000/体长(cm)。

3)胆固醇和甘油三酯于实验结束后,采集动物血清,采用相应试剂盒进行测定。

6.数据处理

(1)四诊指标的数据处理

1)用Excel表格建立原始检测数据库,不同日期的检测插入新表,形成完整证候演变档案。每张表的“行”为不同组别、各动物及其编号,“列”为各检测内容,及实测值和换算值。包括:饮水量、摄食量、体质量、抓力、腋温、爪r值、尾r值、水平、直立等。

2)求出正常对照组各指标均数。

3)求出各组大鼠实测值与正常对照组均数的比值。

4)为校正各组大鼠与正常对照组客观存在的体质差异,第一次各组与正常对照组均数的比值,用于各组历次检测值的校正。校正值用于统计分析。

5)汇总不同日期检测的各组大鼠数据,用以观察证候的发展和演变。

(2)计量化辨证数据处理

1)气盛衰度

气盛衰度=各动物水平移动比值×0.6+各动物直立次数比值×0.4

2)阴盛衰度

阴盛衰度=各动物体重/正常组均数

3)阳盛衰度

阳盛衰度=各动物腋温比值×0.5+各动物爪r值比值×0.3+各动物尾r值比值×0.2

7.统计分析

全部数据采用SPSS11.5统计软件进行方差分析,检验水准α=0.05。变量均以-x±s表示。

二、实验结果

1.疾病特殊指标

(1)血脂含量

1)不同组别血脂含量的比较:与正常组比较,高脂1组和高脂2组胆固醇均显著升高(P<0.05,P<0.01),而甘油三酯均显著下降(均P<0.05),其中高脂1组的胆固醇升高幅度和甘油三酯下降幅度均高于高脂2组,另外高脂1组和高脂2组比较,胆固醇浓度亦存在显著性差异(P(0.05)。提示加入高蛋白的高脂饲料(饮食结构的改变)较单纯高脂饲料对血脂的影响小(图4-8-1)。

2)不同个体血脂含量的差异:图4-8-2和图4-8-3分别显示高脂1组序号为No.13、No.20号大鼠和高脂2组序号为No.25、No.27号大鼠的TC和TG的含量相差明显,同时显示TC高的大鼠,其TG也高,即对于同一只大鼠,其TC和TG的变化具有一致性,只是变化幅度不尽相同。由此可以推论,不同大鼠对相同配方或不同配方的高脂饲料的反应不尽相同,存在较大的个体差异。

(2)血糖含量

1)不同组别血糖含量的比较:与正常组比较,高脂1组和高脂2组的空腹血糖和糖负荷2h血糖有升高趋势,其中高脂1组空腹血糖显著高于正常组(P<0.05)。而高脂1组和高脂2组间的空腹血糖和糖负荷2h血糖均未见显著差异。提示长期持续喂饲高脂饲料,以及高蛋白加高脂饲料,可致大鼠糖代谢出现紊乱(图4-8-4)。

2)不同个体血糖含量的差异:图4-8-5和图4-8-6分别显示高脂1组序号为No.11、No.15、No.19号大鼠和高脂2组序号为No.21、No.23号大鼠的空腹血糖和糖负荷2h血糖的含量相差明显,但在同一只大鼠,两者的变化趋势不完全一致,如高脂1组No.11的空腹血糖在图中3只大鼠中低于No.15,但其糖负荷2h血糖却明显高于No.15。高脂2组的No.21和No.23也是这种情况。提示长期高脂饲料致大鼠血糖代谢紊乱也存在个体差异,对空腹血糖和2h血糖的影响程度也存在差异。

(3)体重、体长及Lee's指数

1)不同组别体重、体长及Lee's指数的比较:高脂1组和高脂2组的体重和体长均较正常组升高,其中以高脂2组升高明显,其体重和体长与正常组比较均有显著差异(分别为P<0.05和P<0.01);另外高脂2组的体长明显大于高脂1组(P<0.05),而两者间的体重无明显差异。但是根据体重和体长计算得到Lee's指数的变化与体重和体长的变化恰好相反,高脂1组和高脂2组均低于正常组,以高脂2组最低,但3组间无显著性差异。提示高脂饲料,尤其是高蛋白加高脂饲料,有助于大鼠体重和体长的增加,但以体长的增加为主,以致Lee's指数降低,大鼠尚未形成肥胖(图4-8-7~图4-8-9)。

2)不同个体体重、体长及Lee's指数的差异:图4-8-10~图4-8-12显示高脂1组序号为No.12、No.20号大鼠和高脂2组序号为No.25、No.26号大鼠的体重、体长及Lee's指数的情况,可直观显示它们之间的个体差异,以上整组比较提示在体重与体长的增加中以体长为主,但个体显示,其中也有以体重增加为主的,如No.12、No.26,它们的Lee's指数明显高于各自组别的平均值(图4-8-9)。

2.证候特征

(1)气的盛衰度变化

1)不同组别气盛衰度的比较:高脂2组随造模时间延长逐渐出现气盛,高脂1组不明显,见图4-8-13。提示高脂饲料,特别是高蛋白加高脂饲料喂饲6周时,大鼠活动增强,气盛明显。

2)不同个体气盛衰度的差异:图4-8-14中的No.18和No.20、No.25和 No.30分属于高脂1组和高脂2组,其中No.18和No.20的气盛衰度的起点基本一致,但随时间的变化,其演变有较大差异。No.25和No.30也有类似情况。提示同种造模方法施加于不同个体,可因个体差异导致其气盛衰度的演变出现差异,即出现同病异证。

图4-8-15显示不同时间不同大鼠可出现类似的证候,虽然造模方法和时间不同,但第13日的No.20(高脂1组)和第40日的No.27(高脂2组)、第27日的No.13(高脂1组)和第40日的 No.25(高脂2组)出现气盛衰度非常接近的现象,即出现异病同证。

(2)阴的盛衰度变化

1)不同组别阴盛衰度的比较:与正常组比较,随着检测次数的增多,高脂1组和高脂2组的阴盛衰度逐渐加强,第27日和第40日,高脂2组与正常组同一时间阴盛衰度比较,差异有显著性(P<0.05),而各时间点高脂1组和高脂2组间阴盛衰度比较,差异无显著性(图4-8-16)。提示高脂饲料,特别是高蛋白加高脂饲料能增加青年大鼠的阴精储备。

2)不同个体阴盛衰度的差异:图4-8-17中的No.14和No.16、No.28和 No.30分属于高脂1组和高脂2组,其中No.14和No.16的阴盛衰度的起点基本一致,但随时间的变化,其演变有较大差异。No.28和No.30也有类似情况。提示同种造模方法施加于不同个体,可因个体差异导致其阴盛衰度的演变出现差异,即出现同病异证。

图4-8-18显示第40日的No.16(高脂1组)和第27日的No.21(高脂2组)、第40日的No.17(高脂1组)和第40日的No.24(高脂2组)的阴盛衰度值非常接近,即出现异病同证现象。

(3)阳的盛衰度变化

1)不同组别阳盛衰度的比较:喂养高脂饲料,大鼠的阳盛衰度与正常大鼠相当或稍微升高,但影响不大(图4-8-19)。

2)不同个体阳盛衰度的差异:图4-8-20中的No.14、No.13、No.17的阳盛衰度的起点基本一致,但随时间的变化,其演变过程不尽相同,即出现同病异证。

图4-8-21显示第13日的No.20(高脂1组)和No.30(高脂2组)、第27日的No.19(高脂1组)和No.25(高脂2组)的阳盛衰度值非常接近,即出现异病同证现象。

三、讨论

1.关于模型

目前高脂血症动物模型主要有先天性、转基因和化学物质诱导3种。前2种来源困难、价格昂贵,应用受到限制。化学物质诱导法在国内应用最为广泛,它主要包括两类,一类是利用化学试剂通过静脉或腹腔注射一次形成;另一类是利用高脂饮食饲喂或灌胃一段时间后形成。通过给动物喂食或灌胃高脂食饵来复制高脂动物模型的方法是目前最常用的方法,此法又称喂养法。本实验采用高脂饮食喂饲形成高脂血症模型。查阅文献发现,高脂血症模型复制所用高脂饲料一般的配比大致为基础饲料占80%左右,胆固醇占1%~2%,胆盐微量,其他就是蛋黄粉和猪油等成分。饲料配方中,猪油、胆固醇等高脂物质是必不可少的,两者的含量变化将会影响模型复制效果。

给予高脂饲料喂饲多长时间即可形成高脂血症?这可能与动物的种类、品系、月龄、性别等有关,对于雄性青年大鼠(体重200g左右),文献报道多见10日即可成模,也有报道35日成模。本实验采用雄性青年大鼠给予高脂饲料喂养42日,虽血清胆固醇浓度有所升高,但升高幅度不大,甘油三酯反而有下降趋势,这与王氏等的报道一致。另外,从Lee's指数来看,模型大鼠未形成肥胖。

目前公认,长期高脂饮食不仅使脂肪代谢紊乱,同时可导致糖代谢异常,本实验发现两种模型大鼠的空腹血糖、糖负荷2h血糖均升高,提示糖代谢已出现紊乱现象。

本实验采用的两种饲料均使大鼠的体重和体长比同期正常大鼠增加,但从Lee's指数的计算结果分析,体重、体长的增长中以体长的增长为主,这可能与动物处于青年期有关,青年期大鼠正处于体格生长期,高营养的食物使其体长的增长比例高于体重增长比例,这类似与人类青少年处于身高增长期,营养丰富者较之缺乏营养者生长速度快。本实验中高脂加高蛋白大鼠的体重、体长较单纯高脂大鼠大,提示高蛋白摄入有利用大鼠的生长。

2.关于证候

比较突出的是高脂高蛋白饲料组,出现逐渐气盛的表现,可能与其饲料配方有关。而其他阴阳证候的改变不很明显。

3.同病异证和异病同证

高脂血症大鼠的同病异证和异病同证的现象十分普遍,个体差异以气盛衰度为显著,其次是阴盛衰度,而阳盛衰度变化不大。这表明,高脂血症模型大鼠与人类相似,具有同病异证和异病同证的特点,在利用高脂血症大鼠进行中医理论或中医药研究时,应考虑大鼠个体的证候差异,进行辨证论治及其疗效评价。

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