血管外修饰脂蛋白:对1型糖尿病小鼠模型视网膜病变的传播作用

来源:Diabetologia September 2016, Volume 59, Issue 9, pp 2026–2035 发布时间:2017年06月07日 浏览次数: 【字体: 收藏 打印文章
摘要:我们的目的是确定1型糖尿病小鼠模型是否血浆脂蛋白渗漏到视网膜并经糖基化和氧化修饰后,有助于糖尿病视网膜病变的发展。
 
方法:模拟血浆脂蛋白在视网膜组织中的渗透,链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠模型的玻璃体腔注射人类高度氧化的低密度脂蛋白(HOG-LDL),天然低密度脂蛋白(N-LDL),或赋形剂(PBS)。并在随后的14天进行视网膜电图(ERG)的组织学和生化指标评估。
 
结果:玻璃体腔注射N-LDL和PBS对糖尿病或非糖尿病动物均不影响视网膜的结构和功能。在非糖尿病小鼠,hog-ldl引起了短暂的炎症反应而不改变视网膜的功能,但对糖尿病小鼠造成严重,渐进性视网膜损伤,形态异常,视网膜电图改变,血管渗漏,血管内皮生长因子的过度表达,胶质增生,内质网应激和凋亡倾向。
 
结论:糖尿病对玻璃体腔注射改性LDL的视网膜损伤易感性。现有的证据表明,淤血,血浆脂蛋白改性有助于糖尿病视网膜病变的传播。玻璃体腔注射HOG-LDL除了产生高血糖外,还能损害血视网膜屏障。
 
关键词:糖尿病性视网膜病变  血脂障碍  脂蛋白   氧化的低密度脂蛋白  发病机理   血管并发症
 
背景:啮齿类动物模型通常用于糖尿病视网膜病变的研究,但它们有局限性。啮齿类动物不发展折磨人类的先进、增殖性视网膜病变。氧诱发新生动物视网膜病变模型表现出新生血管,但动物不是糖尿病模型。对于一个可能渗出的脂蛋白在糖尿病视网膜病变的传播作用,啮齿类动物和人类之间的关键区别在于他们的脂蛋白代谢:啮齿类动物的低密度脂蛋白水平比人类低,胆固醇主要以高密度脂蛋白运输。因此,糖尿病动物模型无法复制淤血的慢性暴露,修饰的LDL其主要表现在人类糖尿病性视网膜病变。在本研究中,使用玻璃体腔注射人LDL(有或没有修改),评估其对糖尿病小鼠模型和非糖尿病小鼠视网膜的影响。
 
方法:动物:雄性C57BL/6J小鼠(7-8周龄),饲养在12 / 12小时明/暗循环的环境(22.5±0.5°C,湿度50±5%)自由采食和饮水。驯化至少一周后,根据重量动物随机分组。用链脲佐菌素诱导1型糖尿病模型(每日50-55毫克/公斤, 连续5天,腹腔注射);非糖尿病组使用赋形剂。28天后被确认为糖尿病(空腹血糖≥16.7 mmol/L),在玻璃体腔内注射前小鼠维持饲养八周。动物没有转换成糖尿病或后来表现出明显的眼内注射损伤的被排除在外。
 
人脂蛋白的制备:从不服用处方药或抗氧化维生素的非糖尿病志愿者(20岁- 40岁)4-6人抽取血液。采用超速离心法制备天然LDL(N-LDL;密度1.019-1.063克/毫升)。为了制备高度氧化糖化低密度脂蛋白(hog-ldl),N-LDL在50 mmol/L葡萄糖(72小时,37°C)抗氧化条件下(1 mmol/L的二乙三胺五乙酸(DTPA),270μmol/L EDTA),透析除去葡萄糖和抗氧化剂,然后在10μmol/L CuCl2(24小时,37°C)进一步氧化。经过广泛透析,对蛋白质浓度进行量化,并进行电泳测定不含内毒素。
 
玻璃体内注射LDL:小鼠使用氯胺酮(100毫克/公斤,腹腔注射)和甲苯噻嗪(10毫克/公斤,腹腔注射),麻醉后接受玻璃体腔注射1μL天然LDL或hog-ldl(蛋白5μG /μL,PBS稀释),或PBS,用36号针头/注射器。无论是天然和hog-ldl被证实在玻璃体内可溶。每一个动物,一只眼睛注射n-LDL或hog-ldl,另一只用PBS作为对照。外源性低密度脂蛋白的眼内动力学尚不清楚,我们的目的是提供一个目标LDL浓度约0.5μg /μl,假设平均玻璃体的容积为10μl。接近人血浆中LDL浓度。假设在糖尿病大鼠视网膜局部ox-LDL浓度可能较高,分布不均匀,呈片状分布[类似动脉粥样硬化斑块。
 
视网膜电图:眼部注射后3、7和14天,记录全场暗适应视网膜电图(ERG)。简而言之,暗适应过夜后,小鼠麻醉,保持在37°C加热垫上。2.5%去氧肾上腺素和1%托吡卡胺眼药水进行瞳孔扩张。将金线电极放置在角膜上双侧同时记录ERGs,参考电极和接地电极分别位于鼻穹窿和尾部。
 
组织学:眼睛固定在(20%异丙醇[V/V]和2%三氯乙酸,4%多聚甲醛和2%氯化锌[W/V])放置70%乙醇后进行石蜡包埋。5μm切片用HE染色。
 
视网膜白蛋白泄漏:渗出白蛋白应用免疫组化法观察视网膜血管渗漏,从而避免潜在的外源性示踪剂对屏障功能的干扰影响。视网膜切片用0.5% Triton X-100封闭10min,然后用一抗(羊多克隆抗白蛋白、1:400)4°C孵育过夜。Alexa Fluor 488共轭多克隆抗羊IgG(1:400)作为二抗。抗体是根据制造商的指示使用的。DAPI进行细胞核染色。尼康E800显微镜下检测免疫荧光。每只眼睛,上、下段图像随机放大10×。所有玻璃体和视网膜(从神经节细胞层到外核层)的像素强度措施被用作血管渗漏指数。
 
视网膜铺片:可视化血管渗漏,双标记的葡聚糖是由心脏内注射麻醉小鼠,10-15 min后,视网膜固定,平面式,奥林巴斯FluoView FV500激光共聚焦显微镜拍照。
 
结果:改良的LDL对糖尿病视网膜小鼠的损伤:图一表明代表在糖尿病和非糖尿病小鼠玻璃体腔内注射hog-ldl或N-LDL或PBS视网膜形态。天然或PBS对视网膜无明显影响,无论小鼠血糖状况,糖尿病动物没有发现任何明显的病理变化。在非糖尿病小鼠,在第7天hog-ldl诱导短暂的感光细胞和神经节细胞层免疫细胞轻度浸润,在第14天解决该问题。相反,在糖尿病小鼠,hog-ldl触发视网膜层广泛的炎症。第3日,在神经节细胞层和玻璃进行检测浸润细胞;第7日,更多的炎性细胞浸润扩展到玻璃体,视网膜色素上皮细胞弥漫性光感受器损伤与肿胀,而在14天,视网膜损伤更为广泛,视网膜结构严重破坏。数据表明,糖尿病模型呈现明显的视网膜LDL损伤高度敏感。
 
改良LDL损害糖尿病视网膜功能,但非糖尿病小鼠:ERGs测定修饰低密度脂蛋白对视网膜功能的影响。与形态学的研究结果基本一致,后玻璃体腔注射PBS或天然是正常的,类似于在非糖尿病动物糖尿病模型小鼠ERG反应。在非糖尿病小鼠ERG,同PBS和N-LDL相比,hog-ldl没有显著影响,但在糖尿病动物,在7天和14天同PBS或N-LDL相比,hog-ldl诱导显著减少光感受器和二阶神经元的功能。
 
改良LDL增加糖尿病小鼠视网膜血管通透性:我们采用了两种技术来评估BRBs的完整性。首先,我们量化外渗在视网膜和玻璃体的内源性白蛋白。在非糖尿病小鼠中,只观察到神经节细胞层的白蛋白染色,治疗组之间无显着差异。相反,糖尿病小鼠玻璃体腔内注射hog-ldl 或N-LDL或PBS增加玻璃体视网膜白蛋白存在,在7天达到统计学意义第3天和14天均出现上升趋势。其次,我们评估了两个荧光素标记物在糖尿病动物视网膜扁平支架上的视网膜渗漏。在PBS或N-LDL组,没有明显的FITC-葡聚糖(2000 kD)或德克萨斯红葡聚糖(3 kD)泄漏。相反,第3天检出hog-ldl导致FITC-葡聚糖(2000 kD)或德克萨斯红葡聚糖(3 kD)的外渗,在7天和14天越来越严重,,尤其是德克萨斯红葡聚糖3 kD的标记。在hog-ldl治疗的糖尿病小鼠视网膜均出现分散的片状荧光素渗漏,类似于临床糖尿病视网膜病变。
 
LDL对糖尿病小鼠诱导视网膜炎症、内质网应激和促凋亡:了解修饰低密度脂蛋白诱导的糖尿病视网膜损伤的分子病理学改变,探讨了小鼠视网膜的胶质细胞激活标志蛋白(GFAP)、血管生成和血管通透性(VEGF),内质网应激和细胞凋亡(Bax)的倾向。hog-ldl同N-LDL对非糖尿病小鼠有大体相似的影响。但对糖尿病小鼠往往引起视网膜GFAP,VEGF,KDEL和Bax表达。一些标志,包括血管内皮生长因子(VEGF),KDEL及Bax,也有明显的时间依赖,其视网膜表达水平逐渐增加。与PBS或N-LDL相比,hog-ldl上调糖尿病大鼠视网膜KDEL,增加神经节细胞层、内核层、和RPE层染色,表明,修饰后的LDL不仅损伤视网膜血管,而且损伤神经和视网膜色素上皮细胞,有助于糖尿病视网膜病变,影响多种视网膜细胞类型。
 
 
 
 
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