方法：离体兔和人角膜巩膜缘放置在器官培养液中，用108金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、腐皮镰刀菌感染角膜。这种感染是用手术刀刺伤的。暴露的角膜或角膜基质注射感染菌悬液。接种后角膜在37°C维持24和48小时。孵育后，角膜是均质测定菌落形成（CFU）/或使用常规染色进行组织学检查。比较单一和混合种感染情况。

结果：观察到同24小时的金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌相比，48小时后CFU显着增加。然而，在感染白色念珠菌或腐皮镰刀菌的角膜中没有观察到这种增加。在大多数受感染的角膜组织中，注射法导致的感染产生大约两到100倍的增长。手术刀的组织学损伤和注射模型表明铜绿假单胞菌在整个角膜中广泛浸润，而金黄色葡萄球菌、白色念珠菌和腐皮镰刀菌的浸润较少。模型还支持双重感染。

结论：手术刀和注射方法均适用于体外兔和人角膜模型的感染。这些简单的和可重复的模型将是检测和治疗体外和体内微生物角膜炎的有用替代模型，特别是可能由两种感染微生物引起。

关键词：离体角膜  角膜炎  菌落形成单位  角膜模型

简介：微生物性角膜炎是世界范围内的一大难题，是导致视力丧失和失明的重要原因。体外细胞培养和体外模型已被用于研究该疾病的不同方面，包括致病性和治疗策略。体内研究需要使用大量的动物模型。这些动物的福利已经成为一个重要的伦理问题。克服这些问题的方法之一是使用体外的细胞单层培养，包括永生或原发性角膜上皮细胞。然而，这并不代表体内的情况。不同的上皮细胞、角膜缘干细胞和角膜基质细胞缺乏一个三维（3D）结构之间的相互联系。

最近，人们利用角膜模型研究角膜炎。但这些模型缺乏免疫元素。这些模型已被用于研究伤口愈合，微生物粘附和分子微生物致病性。在我们的实验室中，使用了体外角膜模型来研究角膜上皮再生和炎症模型。通过在角膜上轻轻摇动培养基，它们可以在培养物中维持至少4周。据我们所知，体外角膜模型中没有进行细菌和真菌感染和混合感染的比较。报告了兔和人角膜中单个和混合种感染的比较，以便更好地理解这些模型在微生物角膜炎中的应用。

材料和方法：材料：使用了两种类型的兔子：野生棕色兔和新西兰兔。两种兔角膜的性能无差异。人角膜来源于角膜库。

兔角膜的分离：用一个标准的程序，用聚维酮碘消毒后，解剖带巩膜缘的角膜，并立即放入磷酸盐缓冲盐水中。

离体角膜器官培养：器官培养如前所述。在35毫米培养皿中放置人和兔的角膜，上皮侧靠近皿底。500μL DMEM培养基-琼脂糖（0.5% w/v）溶液移进角膜的内皮侧。溶液被凝固，然后翻转皿，使上皮面朝上。培养基DMEM: Ham's F12含有10%胎牛血清的，100 U /ML青霉素100 U /ML链霉素、2.5μg/L两性霉素B，5μg/L胰岛素和10ng/mL表皮生长因子（EGF）添加到淹没的角膜中。在感染前，用PBS清洗角膜三次，并在无抗生素和无真菌培养基中孵育至少24小时，以去除残留的抗菌剂。所有实验工作都是在英国的兔眼角膜和印度的人类角膜上进行的。

细菌和真菌培养：兔角膜使用的菌株金黄色葡萄球菌（s-235）、铜绿假单胞菌（som-1）、白色念珠菌（SC5314）和腐皮镰刀菌（NCPF 2699）。人角膜使用的菌种有金黄色葡萄球菌（25923）、铜绿假单胞菌（27853）和白色念珠菌（90028）。所有的细菌和真菌菌株在脑心浸液琼脂中培养（BHI），37°C过夜，然后保持在4°C。为了实验需要，将琼脂中的单克隆放入肉汤培养基中，37度培养过夜。固定相微生物应用于兔角膜实验中。对于人类角膜实验，在角膜接种日，接种新鲜肉汤，根据预定生长曲线接种。

体外角膜感染：角膜用手术刀伤害（3条垂直斜线，和3条水平斜线），金属环扣放在角巩膜上，创建一个防水密封空间。在金属环中央区域接种108金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、铜绿假单胞菌或腐皮镰刀菌。或注射相同数目的细菌。在37°C，受感染的角膜培养24或48小时，然后均质和由此产生的悬浮液稀释后，进行琼脂平板菌落计数。受感染的角膜也经处理，切片（细菌）用革兰氏染色和（真菌）用周期性酸-希夫（PAS）染色。未接触微生物的角膜被用作对照。

角膜表面微生物的成像： 4°C，使用1mg/ml异硫氰酸荧光素（FITC）标记金黄色葡萄球菌或铜绿假单胞菌，后用PBS洗四次。真菌，整个角膜覆盖在1:1荧光增白剂与10%氢氧化钾（v/v）10 min，后用PBS洗涤三次。细菌和真菌感染的角膜用荧光显微镜成像。

结果：兔眼角膜和人眼角膜的宏观观察：感染细菌和真菌的角膜与未感染的角膜相比，混浊度明显增加。所有的角膜都可见划痕，但感染的角膜比未感染的角膜更为明显。在受感染的兔和人角膜中显示FITC标记的细菌。在24小时和48小时发现金黄色葡萄球菌覆盖角膜表面。在某些部位能检测到直径为5～25μm的细菌丛。另一方面，在24和48小时后铜绿假单胞菌感染的角膜比金黄色葡萄球菌观察到的团块少。对荧光增白剂染色白念珠菌感染的角膜表面微观显示更均匀的扩散，24小时后角膜表面出现少量菌丝。但48h后显示白念珠菌分布及菌丝均增加。在兔和人眼角膜的不同位置，24h时腐皮镰刀菌显示有更多的菌丝分布。48小时后，角膜表面被一层真菌覆盖，菌丝可以观察到延伸到划痕和所有方向，远离真菌体。兔眼角膜和人角膜表面的细菌和真菌的覆盖率相似。

兔和人角膜单种菌感染：注射方法包括在基质中引入细菌和真菌，相比于手术刀的方法，24小时后，单一物种生物注射导致较高的CFU /角膜（P < 0.05），白色念珠菌除外，其他差异不显著。可以看到铜绿假单胞菌覆盖上皮和浸润整个后弹力膜。这与接种方法无关。人角膜和兔眼角膜中白色念珠菌的分布相似。酵母细胞和菌丝元素接近划痕部位，未浸润超过150μm的基质。48小时后菌丝数和白念珠菌细胞进入间质的数量与24小时后观察到的无显著差异。24小时腐皮镰刀菌对组织的穿透力小于白色念珠菌，接种部位的基质渗透量不超过10μm。但穿透深度和数量均在48 h后增加。

角膜的两种菌感染：在两种病菌模型中，我们能够从感染的兔子和人类角膜中覆盖的细菌种类。与单种感染相比，铜绿假单胞菌的细胞浸润在基质，包括后弹力膜，而金黄色葡萄球菌显示在超出注射部位点传播。白色念珠菌和铜绿假单胞菌混合感染是临床上最常见的感染。在这种混合感染的体外模型中，两种角膜在手术刀损伤后24小时内被细菌覆盖，铜绿假单胞菌在菌落计数和组织学上显示出优势。

结论：我们达到了建立人类和动物角膜再生感染的目的。毫无疑问，没有模型（包括动物）是自然人感染的理想替代品。尽管如此，得到的数据仍然是有用的。我们证明，可以建立一个可重复的体外细菌和真菌感染模型，可回收细菌/真菌的最终数量与自然在体内实验相媲美。这些模型现在被用于微生物检测系统的评价中。