背景：由于癌症、外伤或先天性畸形导致组织丢失，膀胱组织的修复是必要的。肠组织的使用仍然是泌尿外科临床上的金标准，但其导致新的问题和功能障碍，如粘液生成，结石形成，严重的是恶性肿瘤。因此，人工生物衍生材料使用是增强这种特殊组织的一个很有前途的步骤。本研究的目的是通过两个胶原支架原型来研究膀胱壁的修复，optimaix 2D和3D，天然和种植自体膀胱细胞。

 

方法：6头小型猪进行膀胱镜手术，组织活检和细胞分离后增加支架植入术。第一次手术六周后，接种组织培养的自体膀胱和逼尿肌细胞连同支架一起植入膀胱。进行膀胱造影和膀胱超声检查显示结构完整性和植入部位的渗漏试验。18、22、32周分别处死2头猪，通过不同的（免疫组织化学）染色程序和双光子激光扫描显微镜检查泌尿系统。

 

结果：两个胶原支架在体内膀胱壁有良好的组织生长能力，能快速连接尿路上皮细胞。随着支架的降解，逼尿肌组织向内生长，在整个研究期间都能观察到。

 

结论：胶原支架optimaix 2D和3D是替代膀胱壁的一个潜在材料。该材料具有良好的生物相容性，在体外具有良好的自体细胞生长，并能很好地整合到体内的膀胱组织中。

 

 

方法：试验设计：6头雌性SPF级小型猪，月龄17.8±1.0，平均体重44.8 ± 3.9 kg.购入后接收兽医临床检查。所有动物在试验前至少要驯化14天。第一操作（OPI），两个optimaix 2D和两个optimaix 3D没有细胞植入到小型猪的腹膀胱壁。切除的膀胱组织进行分离和UCS、SMCs组织培养。3周后支架与自体组织培养的UCS和SMCs一同植入，植入前三周内支架在保温箱中。第二操作，植入的optimaix 2D和optimaix 3D中的一个支架被去除，被一个合适的、新鲜的相同规格的天然2D或3D支架替换。6周后初步评估植入-宿主融合情况。两细胞种植的optimaix 2d支架复合物植入右背部膀胱壁，一个细胞种植的OptiMaix 3D支架植入左背部膀胱壁。在第二操作后18, 22和32周每次处死两头猪，检查泌尿系统。根据支架制造商的设想，植入后14-15周支架被降解完全。相反，人造胶原块仍然可以找到。通过在一个动物中执行两次操作，可以根据3R原则获得更多有关植入宿主组织整合的时间尺度的信息。

 

手术操作：植入前optimaix 2d支架进行适当的裁剪以适应定制的，椭圆形的聚四氟乙烯播种环（3.3平方厘米）。这种预切法与第二次手术中植入的支架进行比较是有基础的。高孔隙（孔径≈100?m）optimaix3D支架被证明是脆弱的，容易损坏，因此需要一个更大的表面来缝合。支架，因此，植入和缝合的交付格式3×4 cm2。术前肌内注射4mg/kg的氮哌酮和0.1mg/kg的阿托品。15分钟后，肌肉注射氯胺酮，10mg/kg。取所有动物血样进行常规血液计数。静脉注射1mg/kg丙泊酚后，动物进行插管麻醉，异氟醚吸入量维持在1 - 1.5Vol%。持续输注芬太尼（0.02毫克/千克）给予镇痛. 在开腹手术过程中，给予0.9%氯化钠溶液输液补偿，速率4 ml/kg h.

 

对手术部位进行清洗消毒后，在下腹中线进行切口。经尿道导管和膀胱被抬高，高于联合处，用200毫升0.9%氯化钠溶液填充。用手术刀和剪刀锋利地解剖指定植入部位的尿路上皮和逼尿肌组织同时创造一个浆膜瓣。支架的大小相当，被转移到含有预热过的改良Eagle's培养基无菌杯中，然后立即放入细胞培养设施中进行处理。胶原支架植入并用可吸收缝线PDS II 4-0固定在所制备的病变部位。不可吸收标记缝线聚丙烯3-0黑色用于2D支架四角，蓝色用于3D支架四角。剩下的浆膜瓣用支架覆盖和PDS II4-0固定。然后用0.9%氯化钠溶液填充膀胱检查渗漏情况。用Vicryl 2-0缝合腹膜、肌肉和皮下组织，Prolene 2-0缝合皮肤。放置一个新鲜的经尿道导管，以避免对愈合的膀胱组织压力。预防性应用抗生素每日两次，卡布洛芬每日一次口服镇痛连续五天。

 

手术后护理：每天检查动物的健康状况。一周后通过造影对膀胱的完整性进行评估。猪被镇静后，高达350毫升的放射性造影剂经尿道导管注入膀胱。如果有泄漏，一个新鲜的经尿道导管留在膀胱，直到1周后第二次随访。对拔除尿管后的猪，在笼内观察24小时的正常饮食和饮水。这种监测也在每次手术之前和之后及终止膀胱功能评估的实验进行。通过视频监控保证排尿时间点和排尿量的大小，一种泌尿外科流量计，由刻度盘和收集容器和相应的软件组成。

 

UCS和SMCs细胞培养：如前所述分离自体UCS和SMCs。尿路上皮和膀胱逼尿肌被从膀胱分割下来进行机械分离细胞。轻轻搅拌后（1小时37°C）库中的在含400ug/ml胶原酶的MEM培养基中37度孵育1h后，轻轻搅拌，用含10%（v／v）胎牛血清的MEM洗涤三次，转移到胶原涂层细胞培养瓶中。UCS在角化细胞- SFM培养中培养，SMCs在选择培养基中培养。选择培养3天，抑制SMC中成纤维细胞的生长。SMCs用平滑肌细胞生长培养基2培养。对培养的细胞定期检测。

 

细胞种植和OptiMaix支架植入：optimaix 2d支架固定在定制的播种环中接种SMCs细胞。Optimaix3D支架平放在培养皿中，然后接种细胞。培养4小时后，培养皿中加入20%的FCS，1%的两性霉素B和1%的庆大霉素。共培养，一天后，SMC种植支架被放置在一个新的培养皿和UCS被种植在支架的另一面。每种类型的额外的支架被接种作为细胞生长的控制组。培养基每隔一天换一次。

 

支架的组织化学和免疫组化染色：一周2次（D1和D4），3mm厚的种植对照组支架被切断，并固定在carnoy' S溶液中4h。固定样品通过提升乙醇浓度脱水，石蜡包埋，切成3?m切片。随后染色，切片经脱蜡，经过一系列低浓度酒精溶液，最终在PBS溶液中冲洗。切片用HE，DAPI和RG染色。

 

实验终止：小型猪如上所述麻醉。通过0.9%氯化钠溶液进行超声检查和膀胱充盈检查膀胱完整性、形态和尿反流。通过尾静脉注射0.16克/公斤巴比妥酸盐对猪进行安乐死。摘取输尿管膀胱和肾脏并称重。膀胱固定24 h，肾、输尿管在4%的甲醛磷酸盐缓冲液中固定七天。

整个膀胱进行组织学评价，重点放在植入部位。肾脏三部分包括肾皮质和髓质，肾盂，以及近端和远端输尿管进行病理检查。对植入的支架以与细胞接种支架以相同的方式进行处理。涉及到样品脱水，石蜡包埋，制备3?m切片。膀胱壁组织化学染色是用nEVG染色法。PanCK是用来识别尿路上皮层，α- SMA用来控制逼尿肌结构。白细胞分化抗原34（CD34）和血管内皮生长因子是识别血管和S100血管神经纤维分布的一个间接指标。

 

双光子激光扫描显微镜（TPLSM）：用双光子显微镜检查为了评估植入支架的降解程度，未染色的切片。为了激发组织中的胶原残余物，激光被调谐到波长为750纳米。

 

结果：细胞种植的支架：基于动物自身条件，细胞分离导致不同细胞培养计数。细胞分离是成功的，4.5×106 UCS和 2.9 ×107SMCS种植到支架上，能得到支架每平方厘米分别有2.4 × 105 (UCs) 和1.6 × 106 (SMCs)个细胞。SMCs被种植到一个多层上的optimaix2D面。3天后，optimaix 2d支架上可见UCS封闭层。培养2周后，组织切片可观察到三层厚的细胞。Optimaix3D支架允许UCS和SMCs细胞渗透，细胞纵向定向向微孔内生长。由于这些微气孔有100um的平均直径，细胞通常与多孔框架的壁相连，而不是填补空隙。

 

手术：optimaix 2D的支架材料的外观和质感类似于湿麂皮，易于缝合到膀胱壁。相比之下，由于其多孔结构optimaix 3D更为精致，初步尝试缝合3D支架到预制的椭圆形中，但以失败告终。利用全3×4 cm2的支架，可以成功地缝合到膀胱壁克服技术上的困难。只有两个原始大小的三维支架植入。六只动物手术后恢复良好，血液参数分析没有发现炎症或感染的迹象。手术过程中发生出血反应，血小板数量已经增加，血红蛋白和红细胞压积值下降。这些值在实验结束时恢复到正常水平。第二次操作后，连续6周有排尿量下降的趋势，但是没有统计学意义。没有尿失禁或尿路感染的迹象。六头猪膀胱造影显示的optimaix3D支架植入部位有2D支架泄漏潜力大。由于多个植入物影响导致膀胱的形态变为轻微的梨形膀胱。然而，在实验结束时，膀胱显示出正常的形状。肾脏没有出现尿反流。每次使用前，在实验结束时，只有进行超声检查，因为造影剂导致水肿在膀胱尿路上皮。每次手术前，实验结束及超声检查时，使用造影剂，因为其能导致膀胱尿路上皮水肿。

 

组织学评价：浆膜层主要是一个同质的封闭层。不同颜色的不可降解的标记线的使用允许的宏观辨证optimaix 2D和3D 支架。标记线，有利于膀胱浆膜粘连到大网膜。在实验结束时，在切除尿道的过程中，必须仔细解剖周围的器官。膀胱重量为89.5±16.2克，左肾平均重量为105.5±22.2克，右肾为108.5±26.8 g。32周后，在内表面仍可见植入部位。未观察到尿道异常。肾脏及输尿管均无任何病理改变，无肾反流发生、膀胱无钙化或结石形成。在第六周，支架结构似乎几乎完好无损，但降解过程已经开始。32周后仍然可见optimaix 2d残余。一个封闭的尿路上皮层与底层的结缔组织在optimaix 2d支架内表面清晰可见。在胶原支架上种植尿路上皮细胞似乎并没有对这一过程产生任何影响。逼尿肌细胞从种植体的两侧向中心生长。播种SMCs细胞前并没有改善生长过程。直到32周，肌肉组织才开始生长。在第6周和18周时，CD34和VEGF染色显示血管通过支架材料生长。血管似乎在22周内变少了，与正常对照组相比，在32周时处于正常水平。32周后仍能观察到optimaix 3D遗核。与2D支架的致密结构相比，6周后，相邻结缔组织在海绵状结构的大孔隙内生长。在这种情况下，用细胞播种也不能加速这一过程， 3D支架在18周是似乎被周围组织包裹住。在22周和32周的四只猪身上找不到这种现象。Optimaix3D孔隙结构有关于尿路上皮的缺点。尿路上皮细胞，如在体外，内衬这些毛孔内，并不能建立支架的封闭层。在6周内，在支架内形成散在的尿路上皮簇。这种现象一直持续到18周，22周后逐渐减弱。32周时，顶部的支架与支架降解上皮有正在进行的重组和关联，可以清楚地看到一个单一的，连续的细胞带。血管和神经纤维生长同optimaix 2D支架相媲美。

 

结论：在这项研究中，OptiMaix支架是非常有前途的膀胱壁的扩大材料。另一方面，optimaix 2D比3D似乎更容易植入，能更快的密封膀胱和对周围组织有更好的反应。另一方面，有细胞和组织植入的3D支架可能是有前途的。对较大缺陷而应用细胞种植的必要性在今后的研究中必须加以评估。