实验性青光眼动物模型中间歇性微创眼压升高后的免疫应答

来源:Journal of Neuroinflammation December 2016, 13:82 发布时间:2017年08月14日 浏览次数: 【字体: 收藏 打印文章
摘要:眼内压升高(IOP)和眼压波动是青光眼的主要危险因素,但其致病作用尚未阐明。除了疾病的多因素病理学之外,自身免疫机制可能与视网膜神经节细胞(RGC)死亡有关。这项研究的目的是确定间歇性眼压升高是否引起神经退行性疾病(I)引发免疫反应(II)及(iii)是否B淋巴细胞毒抑制剂Belimumab减少RGC死亡。
 
方法:间歇式高眼压模型(ioht)LE大鼠(n=21)进行27个单侧眼压升高模拟。这些动物中9只接受belimumab,七只大鼠作为正常对照组。PPD染视神经的横截面分析轴突密度。视网膜的横截面进行针对Brn3a,Iba1,和IgG的免疫组化染色。采用ELISA和蛋白芯片测定血清IgG浓度和IgG活性。
 
结果:波浪眼压曲线导致显著的视神经轴突神经变性。Belimumab治疗的间歇式高眼压动物仅表现出稍高的轴突存活和降低血清IgG浓度。所有受损的视网膜均可见神经炎、小胶质细胞活化显著上调和自身抗体IgG沉积。间歇式高眼压显著升高血清中针对谷胱甘肽-S-转移酶、转铁蛋白的自身抗体,且同轴突密度呈负相关。
 
结论:间歇性眼压升高足以引起视神经和视网膜神经变性。引起IgG抗体反应性变化。虽然B淋巴细胞活化的抑制不能改善轴突存活,损伤与自身抗体反应性变化的相关性表明自身抗体谱可以作为青光眼的生物标记物。
 
关键词:青光眼  高眼压  压力波动  神经变性  视网膜神经节细胞  体液免疫系统  自身抗体  B淋巴细胞抑制剂belimumab
 
背景:青光眼是世界范围内致盲的主要原因之一,眼内压升高(IOP)被认为是主要的危险因素。青光眼的病理是多方面的,定义为一种异质性视神经病变基于视网膜神经节细胞(RGC)缓慢的渐进性丧失。除了其他因素,如血管功能障碍,氧化应激,或视网膜谷氨酸和一氧化氮的毒性,炎症和自身免疫机制已被证明RGC死亡在病理学中发挥重要作用。这些自身免疫机制的特点是青光眼患者血清和房水自身抗体模式的改变。改变自身抗体谱不是青光眼一个独特的现象,在神经退行性疾病中,体液免疫系统也参与了阿尔茨海默氏症(AD)和帕金森病(PD)的病理学。AD和帕金森病患者在视网膜和视神经以及视觉系统的其他区域表现出病理变化,导致感知、色觉或对比敏感度受损。一种微创的动物模型是最近成立的用来诱导间歇高眼压(ioht)。这种新的模型被认为是在实验中增加眼压的最小侵入模型,并避免了由于更多的侵入性方法可能发生的强烈的人工免疫反应,如珠状阻塞或激光光凝。采用实验性青光眼动物模型,假定体液免疫的主要的变化发生在施加的压力和/或视网膜神经节细胞的损失。越来越多的研究表明青光眼患者眼压波动与疾病进展之间存在联系。
 
方法:动物:8周龄的LE大鼠,饲养在12h光暗周期的环境中,自由采食和饮水。二十八只动物随机分为三组:Ctrl(n = 7),ioht(n = 12)和ioht+Belimumab(n=9)。
 
眼压测量:眼压监测通常在上午9点到晚上12点使用tonolab眼压计对清醒动物检测眼压。大鼠保持水平方向,头部处于放松状态。在测量过程中,头部没有施加压力。动物们习惯于快速眼压测量。所有测量都是由同一个检验员进行的,从十次连续测量得出平均值。麻醉大鼠的眼压测量在调整环前和后立即进行,或在整个操作过程中每五分钟进行一次调整。ΔIOP被定义为综合眼压,在ioht间歇期眼睛暴露。
 
实验装置:根据先前描述的微创短期眼压升高技术,ioht是波浪形进行。调整右眼角膜缘周围的硅环,有可能缩小虹膜角膜前角不改变眼睛的形状或引起眼球的后续结构损伤,通过定期眼底检查监测。硅环未放置于角膜缘后方,位于角膜缘周围。硅环稍压迫Schlemm管、巩膜静脉。引起房角边缘移位,导致房水流出阻力增加。大鼠用0.185毫升/公斤美托咪定麻醉。眼睛使用润滑液避免角膜脱水和预防浅表炎症。一旦硅环附在眼睛周围,眼压立即上升,但在没有调整环路的情况下,在几分钟内恢复到基线水平。如果平均眼压低于所期望的水平,则缩小环的直径。相反,当平均眼压过高时,温和释放增加了环直径。模仿眼压波动,常见的青光眼患者的眼压,波浪形眼内压分布于动物的眼睛。包括三个20分钟间隔, 35毫米汞柱(间隔I),45毫米汞柱(间隔二),35毫米汞柱(间隔三)。该硅环在第二和第三时间间隔内被移除10分钟,以模拟眼压下降到生理IOP水平。眼压升高持续五天,休息2天,连续5周。第6周,连续两天眼压升高,随后处死动物。因此,每只动物总共获得27个单侧眼压升高。一组接受高眼压(ioht),而另一组接受10毫克/公斤的B淋巴细胞抑制剂belimumab,对照组动物接受同样的检查,在相应的时间,但不进行ioht损伤。在体内实验的最后,所有的动物吸入CO2后心脏采血,接受4%的多聚甲醛/肝素心肌灌注(PFA,2000 U / L)。
 
视神经轴索减少的定量研究:0.7微米半薄的横视神经切片,2毫米的视交叉远端,对苯二胺(PPD)染色,按先前描述的进行轴突密度的测定。在预定的横向模式在×10倍(2 C),从每个视神经的一个代表性部分拍摄了15幅图像。这种取样方法占整个视神经断面的32%。用ImageJ软件轴突密度定量半自动算法包含以下步骤:(1)图像被转换成8位格式;(2)自动阈值设置是由一个独立的观察者对动物的状态进行人工验证和纠正;(3)用粒子分析仪最后确定了轴突的数目。视神经断面的Axon密度显示为轴突数/ 0.05平方毫米。
 
RGC的分析和gG自身抗体和小胶质细胞的免疫检测:对于每个染色过程,每只眼5个10μM矢状断面进行脱蜡、水化,在0.5%双氧水溶液中阻断内源性过氧化物酶30分钟。脑特异性/ POU结构域蛋白3A(Brn3a)免疫组化染色作为RGC标记。在70°C时,在靶提取液中进行50分钟的抗原回收。然后在2% BSA / 0.1% Triton X-100/PBS溶液封闭60分钟。用封闭液稀释山羊抗brn3a抗体(1:400),同标本在4°C下孵育过夜.PBS冲洗切片,辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗羊IgG(PBS稀释1:400)在室温下共孵育3 h。
 
IgG抗体染色,在90°C,在TRS溶液中煮沸45分钟。用1% BSA / 0.1% Triton X-100/PBS溶液封闭10分钟。羊抗鼠IgG酶标抗体(封闭缓冲液稀释1:500)和切片孵育过夜。PBS冲洗后, DAB显色。所有的切片用苏木精复染、脱水、封片。每个参数的数据来自每个眼睛四个有代表性的横截面,包含视神经头,以确保相应的视网膜位置。细胞数量是按每1mm视网膜长度计算。
 
血清IgG浓度测定:从心脏抽取血液,在室温下凝结。10°C 4000转离心10 min。用大鼠IgG elisa试剂盒测定所有动物的血清IgG浓度。剩余的血清样品存放在-20°C。
 
结果:清醒大鼠眼内压与高眼压:清醒动物的IOP值保持在正常的生理范围为10和13.3毫米汞柱,在整个研究过程中没有显示出显著的变化。在麻醉动物ioht程序中记录眼压。总的来说,60分钟的眼压升高导致Δ眼压汞柱为748±12毫米。Belimumab治疗不干扰ioht减弱,发现了类似的Δ眼压756±20毫米汞柱。
 
间歇性高眼压改变视神经轴突数和RGC密度:视神经的轴突密度分析显示,与对照眼相比,ioht受伤的眼睛轴突密度减少11.9%,ioht受伤的对侧眼睛轴突密度减少1.5%。与对照眼相比,ioht +belimumab受伤的眼睛轴突密度减少7.5%,ioht +?belimumab受伤的对侧眼睛轴突密度减少1.9%。与ioht组相比, ioht+belimumab组受伤的眼睛显示出稍高的轴突密度(4.9%)。与未处理的对照组动物和未受伤的对侧眼获取的视神经显示较小的神经退行性变化迹象,如髓鞘轴突肿胀、破裂或胶质细胞增生。仅在接受ioht的视神经切片发现频繁的轴突损伤和胶质细胞增生,不论其是否接收belimumab治疗。接受ioht动物显示正常视网膜的形态,但是有19% RGC的重大损失。此外,ioht组对侧眼的表现出轻微的RGC损失。belimumab治疗组动物在ioht后,显示RGC密度降低。
 
视网膜小胶质细胞和IgG自身抗体沉积的形态计量和分布:检测视网膜小胶质细胞活化,免疫组化染色视网膜截面,在几乎所有的视网膜显示Iba1阳性细胞的发生。ioht组Iba1阳性细胞的数量显著高于对照组,但同ioht+belimumab组几乎相同。ioht组大多数的小胶质细胞位于神经节细胞层呈变形虫状表型。而小胶质细胞呈分枝的形态。在测定视网膜小胶质细胞的百分数分布时,对照组眼的小胶质细胞主要分布在神经节细胞层(44%)和内核层(35%)。在ioht组总的小胶质细胞数量增加。在ioht+belimumab组、损伤眼神经节细胞层可见较多小胶质细胞。
 
眼压升高对体液免疫反应的影响:ELISA法测定各组血清IgG滴度。14周龄对照组大鼠平均抗体滴度有2.55±0.66ng/ml。Ioht组动物表现相近的IgG水平2.74±0.38 ng/ml。在对照组和ioht组相比,使用belimumab显著降低抗体滴度到1.80±0.24 ng/ml。
 
结论:单侧间歇性眼压升高导致视神经RGCs和轴突显著下降,伴有双眼视网膜小胶质细胞的活化及自身抗体IgG的沉积。ioht组,由于与眼压增高RGC损失系统的免疫反应,显著增加血清IgG的反应性以及对谷胱甘肽S-转移酶,血影蛋白和转铁蛋白的IgG阳性。使用BAFF受体阻滞剂belimumab阻碍B淋巴细胞活化导致血清IgG浓度显著降低,免疫调节,降低谷胱甘肽S-转移酶-血影蛋白和转铁蛋白免疫反应,但只有有限的能力来改善轴突与RGC的损失。本研究洞察了眼压,免疫反应和RGC损失之间的联系。然而,将来需要更多的研究来了解体液免疫反应的起源,关注青光眼和其他神经退行性疾病的细胞相互作用。
 
Baidu
map