背景:药代动力学研究是药物开发和优化的关键。虽然血液样本可以收集在EDTA,肝素或含柠檬酸的试管用于估计血浆中的药物水平,但更常用的是EDTA管。本研究的目的是探讨抗凝剂对生物药物的影响。选择六种广泛应用于癌症治疗的药物。Wistar大鼠(n = 6 /每种药物)培美曲塞(50毫克/公斤),伊马替尼(50毫克/公斤),厄洛替尼(25毫克/公斤),美罗培南(60毫克/公斤)6-巯基嘌呤(20 mg/kg)和伏立康唑(6毫克/公斤)。给药后2h,从眼眶后静脉采集血液样本。血液收集在含EDTA、肝素,柠檬酸钠(TSC)和无抗凝管中。通过高效液相色谱分析测定这些样品中的药物水平。单因素方差分析和图基检验确定抗凝管药物浓度的统计学差异。p<0.05被认为具有统计学意义。
结果:厄洛替尼和美罗培南的抗凝管浓度差异有显著性,而培美曲塞呈临界统计学意义。TSC管高估了厄洛替尼的水平,肝素管低估了美罗培南的浓度,EDTA管高估了培美曲塞的浓度。
结论:仔细挑选抗凝剂对准确地描述药物的药代动力学是必需的。常规使用EDTA管可能导致药代动力学数据的错误解释。
关键词:抗癌药物 生物分析 血浆 抗凝血剂 药物(代谢)动力学 治疗药物监测
背景:适当地选择、取样和储存用于估计药物水平的生物样本是很重要的,但在日常实践中有时会被忽视。血液是最重要的临床标本之一,因为它提供了独特的优势,大量公布的数据为动物死亡前和死亡后药物浓度分析,从药理学角度看模型的解释价值。血液样本可以在试管中收集,有多种防腐剂、抗凝剂和其他添加剂的选择,随后储存在室温、冷藏或冷冻中。其目的显然是维持样品及其感兴趣的药物或代谢物在从收集时间到分析时间不会降解。药物测试实验室必须开发样本分析的方法,以便对数据进行准确的估计和解释。例如,药物与所用收集管的类型之间的相互作用并不少见,应在分析方法开发过程中加以说明。在临床试验和常规病人护理中准确测定人体血液样本中的药物水平是极其重要的。例如,治疗药物监测(TDM)根据先前剂量的水平指导药物的进一步剂量选择。如果剂量根据错误报告的药物水平进行修改,它可能导致亚治疗水平或潜在毒性。抗癌药物和一些抗微生物治疗窗窄、高毒性,分析物的适当测定对TDM至关重要。EDTA、肝素,柠檬酸钠(TSC)是常用的抗凝剂。然而,文献中没有广泛报道抗凝剂对血药浓度测量的影响。因此,我们研究了三种常用抗凝剂,EDTA,肝素和柠檬酸对六种常用药物在癌症治疗中血浆药物浓度的影响。
方法:动物:任一性别的Wistar大鼠(体重范围250± 20g)被用于研究。实验室保持在标准温度条件下(25±2°C)和相对湿度(55±10%)。动物进行12:12 h光暗周期。动物饲养在标准笼具中,并适应一周。
试验方案:选择治疗肿瘤常用的六种药物:6-巯基嘌呤(6-MP),,美罗培南,厄洛替尼,伊马替尼,伏立康唑和培美曲塞。Wistar大鼠(n = 36)随机分为六组,各组均腹腔注射50毫克/公斤的培美曲塞,50毫克/公斤的伊马替尼,25毫克/公斤的厄洛替尼,60毫克/公斤的美罗培南,20毫克/千克的6-巯基嘌呤和6毫克/千克的伏立康唑。给药后2小时,从眶后丛静脉取血。由于半衰期短,6-巯基嘌呤在给药后1h取血。根据文献资料,确定了采集剂量和时间点,并报告这些药物在大鼠体内的半衰期,使药物浓度在我们的HPLC分析的线性范围内。每只动物的血样采集在三个含有不同抗凝剂的试管,即肝素、EDTA、TSC和第四个不含任何抗凝剂收集管中。采集后,每个集合管于3000 rpm离心分离血浆,室温条件下使用高效液相色谱法进行进一步分析药物的浓度。
样品准备:
伊马替尼:1000ul ACN加入100uL血浆中。涡旋5分钟,然后在室温下以15000 rpm离心10分钟,900uL上清液随后在40度干燥35min。完全干燥之后,加入预混液100uL(ACN 80%,水20%),涡旋5分钟,并于15000 rpm离心10分钟。90uL上清液转移到自动进样瓶和30uL注入高效液相色谱仪中。
厄洛替尼:1000ul ACN加入100?L血浆中。涡旋5分钟,然后在室温下以15000 rpm离心10分钟,900uL上清液随后在40度干燥35min。完全干燥之后,加入预混液100uL(ACN75%,水25%),涡旋5分钟,并于15000 rpm离心10分钟。90uL上清液转移到自动进样瓶和30uL注入高效液相色谱仪中。
6-巯基嘌呤:100uL血浆与50uL DTT(75mg/ml溶于水中)、25uL水和25uL高氯酸混合。涡旋5分钟,然后在室温下以15000 rpm离心10分钟。150uL上清液放在水浴锅中(100°C)45分钟,然后冷却至室温,转移到自动进样瓶和30uL注入高效液相色谱仪中。
伏立康唑: 800ul ACN加入100uL血浆中。涡旋5分钟,然后在室温下以15000 rpm离心10分钟,100uL上清液加入100ul缓冲液(10 mM醋酸铵,pH 5),涡旋2 min后在15000 rpm离心10分钟。100uL上清液被转移到自动进样瓶和50uL注入高效液相色谱仪中。
美罗培南:固相萃取是用固相萃取柱进行的。固相萃取柱用1 mL甲醇后用1毫升的平衡缓冲液冲洗。血浆(100uL)被装入萃取柱。二次洗涤用500uL平衡缓冲液(pH 6.2)进行。然后将样品用500ul 100%乙腈洗脱液洗脱后进行干燥。样品与100uL预混液混合,涡旋2分钟后,12000转离心。90uL的样本被装入HPLC小瓶和30uL加入柱中。
培美曲塞:固相萃取是用固相萃取柱进行的。固相萃取柱用1 mL甲醇后用1毫升的平衡缓冲液平衡洗。血浆(100uL)被装入萃取柱。二次洗涤用500uL平衡缓冲液(pH 6.2)进行。然后将样品用500ul 100%乙腈洗脱液洗脱后进行干燥。样品与100uL 100 mM K2HPO4 (pH 6.2)预混液混合,涡旋5分钟后,15000转离心10min。90uL的样本被装入HPLC小瓶和30uL加入柱中。
结果:从图中可以看出,在同一抗凝剂组中,我们观察到了显著的动物间变异性。方差分析显示,厄洛替尼和美罗培南的浓度差异有统计学意义,而图3所示的各种抗凝血剂之间的临界统计学意义。相比于EDTA和TSC型管,肝素管明显低估美罗培南的浓度。这种观察的意义在于美罗培南是一种具有抗菌活性的时间依赖性抗生素,如果血浆浓度超过至少40%的给药间隔的靶菌的最小抑菌浓度(MIC)。在这种情况下,使用肝素管进行血液采集可能严重低估了MIC以上的时间,从而造成不必要的剂量修正。以厄洛替尼为例,TSC管大大高估了药物的浓度。培美曲塞,EDTA管的浓度往往高于肝素管,但差异无统计学意义。伏立康唑,伊马替尼和6-MP没有观察到抗凝血作用。常用的血液收集抗凝剂包括EDTA、肝素和柠檬酸盐,EDTA是最常用的抗凝剂。EDTA是一种已知的螯合剂和不用于评估金属离子。例如,顺铂是用肝素涂层的试管收集的。识别这种相互作用对于减少外界因素对分析物浓度的影响至关重要。除少数几个例子外,抗凝剂影响药物浓度测量的机制还不清楚。
准确分析检测物浓度是临床所面临的最重要挑战之一。我们的发现提供了有说服力的论据,有助于确定抗凝剂与被分析物的相容性。我们研究的一些局限性包括样本量少导致统计能力不足。
结论:总之,抗凝药物的选择影响了6种药物中三种血浆浓度的估计。抗凝剂对药物水平估计的影响应是选择合适的抗凝剂以准确地表征药物药动学的一个指导因素。EDTA作为抗凝剂的选择值得怀疑,可能导致某些情况下药代动力学数据的错误解释。