方法：在这项研究中，我们设计了一个快速和可靠的通过结合活体成像系统（IVIS）和荧光定量聚合酶链反应（PCR）分析测定动物血CTCs。对正交异性乳腺肿瘤荷瘤小鼠采用三维成像的IVIS谱CT系统。

 

结果：我们在临床前动物模型建立测量CTCs的快速、可靠方法。该技术的关键是绝对qPCR系统下使用对小鼠外周血DNA / RNA的人和小鼠特定GUS引物.IVIS癌细胞监测的高灵敏度是通过测定MDA-MB-231的细胞荧光素酶进行。MDA-MB-231细胞数经尾静脉注射，IVIS亮度信号经拷贝数定量计算修正。此外，应用正交异性植入动物模型，我们成功地区分了异种移植瘤小鼠和对照小鼠，差异有显著性。而四谱CT三维–可视化显示肺转移瘤小鼠的血中CTC数比普通的荷瘤小鼠增加两倍以上。我们证明外周血中肺转移状态与CTC数量呈正相关。

 

结论：本研究开发的技术将CTC评估集成到体内和体外的临床前模型中。这将有助于在临床实践中的翻译靶向治疗。

 

 

背景：癌转移是癌细胞从原发肿瘤扩散到体内某个或多个其他部位的过程。超过90%的癌症相关死亡与癌症转移有直接关系。事实上，所有的癌症都可以形成转移性肿瘤，包括血液和淋巴系统癌症（白血病、多发性骨髓瘤和淋巴瘤）。转移性肿瘤细胞通过两条主要干道淋巴管和血管传播，在肺、肝、脑和骨骼等共同部位形成继发灶。目前对肿瘤转移发展的认识主要来自于小鼠模型。它是目前已知的一个转移的形成是一个复杂的分子级联，癌细胞离开原发肿瘤的部位（血管），进入血液或淋巴管（循环），并传播到遥远的解剖部位（逮捕和外渗），它们可以在靶器官部位（定植）生长继发性肿瘤。在这个过程中，有一种称为基质金属蛋白酶（MMPs）作为“分子剪刀”分泌癌细胞通过抑制癌细胞的迁移运动的蛋白质。转移癌细胞在远处器官中形成继发灶的成功率很低，从原发肿瘤细胞估计率为0.01%。这个成功率低的原因可能包括以下几个方面：（1）癌细胞通常与周围的邻居及其周围的蛋白质网络紧密相连，其他任何脱离细胞可导致癌细胞死亡（凋亡）；（2）与其他血细胞相比，癌细胞通常相当大，而且在穿过血管时很容易被破坏或卡住，从而导致细胞死亡；（3）免疫系统中的细胞可以识别和破坏高度异质性的癌细胞。；虽然某些类型的转移癌可以用目前的治疗方法治愈，但大多数不能。因此，这些疗法的首要任务是缩小癌症或减缓其生长速度，以帮助缓解癌症相关症状。循环肿瘤细胞（CTCs）是癌细胞已经从原发肿瘤的血管中脱落，并在血流中循环。其中一些CTCs能获得从血管中渗出的能力并继续寄生将肿瘤扩散到远处的重要器官并导致大部分癌症患者死亡。在最近的几十年里，许多组织试图开发新的检测肿瘤患者外周血循环肿瘤细胞的诊断分析。通过应用这些尖端技术，抗转移疗法可以阻断病人的癌症转移。如果转移癌细胞可以保持休眠状态，这将使癌症变成一种慢性但易于控制的疾病。最近的转移研究取得了突破性进展，三类基因已被区分为转移起始基因、转移进展基因和转移毒性基因，其功能的获得和特异性使肿瘤细胞能够循环、靶向、穿透和定植远处器官。转移起始基因为原代肿瘤细胞进入循环提供了机会。这些基因具有细胞运动，侵袭，和血管生成相关的能力，使肿瘤细胞在微环境中靶向血管，进入循环，并传播到遥远的器官。肿瘤转移基因有助于原发肿瘤的发生，发挥更利于转移部位的功能。在转移性定植过程中，这一过程作为原发肿瘤生长的限速功能。转移毒性基因为次级定植位点提供了选择性优势和攻击性。这些基因很少在原发肿瘤中呈现“预后不良”的基因表达特征。除了这些转移基因外，已经鉴定出近30个转移抑制基因。在这项研究中，我们的目的是设计一种快速和可靠的使用生物发光成像和实时荧光定量PCR分析结合方法来监测小鼠体内的人循环肿瘤细胞。

 

方法：细胞培养：人类乳腺上皮腺癌细胞株培养在DMEM/F12培养基中。在37℃的培养箱中，用5%的CO2与10%牛血清，100单位/毫升青霉素和100毫克链霉素一起孵育。

 

转染与细胞系选择：MDA-MB-231细胞电穿孔转染pcDNA3质粒表达萤火虫荧光素酶基因。简而言之，5×106细胞，PBS洗两次，加入10μg质粒。48小时后用G418选择稳定细胞系（6毫克/毫升）。MDA-MB-231细胞用于研究体内人-发光衍生物。

 

动物实验：四周大的严重联合免疫缺陷（SCID）小鼠，所有手术均在异氟烷麻醉下进行，并尽一切努力减少痛苦。在实验过程中，小鼠没有受到肿瘤引起的应激或异常行为。兽医每天监测一次动物的健康状况。食物和水每两天更换一次。

 

生物发光（IVIS）和肿瘤的多模态成像：生物发光成像是一个高度敏感的，冷却CCD照相机装在轻型标本箱中。在体内成像，动物尾静脉注射给予编号荧光素酶报告基因稳定表达的MDA-MB 231乳腺癌细胞（1×105, 104, 103，102细胞和PBS对照组）。15分钟后，小鼠腹腔注射D-荧光素（200毫克/公斤）。动物被放在照相机盒子内的暖台上，并连续暴露于2.5%异氟醚以维持成像过程中的镇静。每组小鼠成像30秒。IVIS摄像系统检测集成，数字化，并显示老鼠发出的光。

 

正交异性乳腺癌动物模型：采用正交异性肿瘤模型，通过使免疫缺陷（SCID）小鼠（6 - 8周龄）来模拟人类癌症。五只小鼠用2%异氟醚麻醉，每只乳房植入5×106荧光素酶表达的MDA-MB-231细胞。以注射PBS的五只小鼠作为对照组。所有小鼠癌细胞注射10周后处死采血，在整个研究过程中，小鼠房间温度（21 - 24 度），相对湿度43 - 65%之间。

 

血液样本：经小鼠心脏穿刺取血100～150ul，按标准分离方案处理。用试剂盒提取人类和小鼠白细胞DNA.样本 DNA浓度至少10ng/ UL。

 

实时定量聚合酶链反应：人GUS引物（正向：AGTGTTCCCTGCTAGAATAGATG  反向：AAACAGCCTGTTTACTTGAG）。小鼠GUS引物（正向：GCAGGCTTTCAAGAGTTCA 反向：TATGAGCTGGTCCTCCATTTC）。1微升的DNA样品和mix，95°C首次变性10分钟，后重复40个循环，95°C变性5s，60℃退火5，72°C延伸10S, 检测荧光强度。进行熔解曲线分析。

 

结果：IVIS检测细胞数：IVIS成像系统观察荧光，通过IVIS检出移植瘤鼠的癌细胞，我们建立了MDA-MB-231乳腺癌细胞基因表达的研究。简而言之，含有荧光素酶质粒导入MDA-MB-231乳腺癌细胞，G418筛选，一个月。IVIS能非常敏感和准确测量稀释的乳腺癌细胞数量。荧光素酶梯度光范围从高亮度（红色）到低亮度。

 

结论：通过IVIS和实时荧光定量PCR分析，我们能够量化小鼠外周血的CTC数量了解肿瘤在乳腺移植过程。此外，三维CT成像系统的信息极大地提高了早期转移瘤的识别率。