摘要：最精确地确定死亡时间（PMI）是法医学的一个重要方面。异质性高，结合各自的死后变化往往限制了许多方法的有效性和充分性。对肌肉蛋白质的死后变化的分析是最近提出的一种估计死亡时间的新方法。分析蛋白质降解的影响因素可能是提高可靠性和准确性的必要条件。在标准化的动物模型上进行了理想的研究，然而需要比较人类和动物组织和特定的情况下蛋白质降解情况。只有当蛋白质降解事件在不同物种中以可比较的方式发生时，它们的发现才能充分地从动物模型转移到人类的应用中。样品来自两个常用的动物模型（小鼠和猪）以及对具有代表不同蛋白质表达谱系统法医案例进行了分析。尽管物种间存在生理和生理差异，但在大多数被调查的蛋白质中，Western blot分析显示出相似的模式。甚至大多数降解事件都以类似的方式发生。然而，在其他一些方面，人类和动物的轮廓描绘了明显的差异。本实验系列的结果清楚地表明，无论何时考虑动物模型，比较研究都具有极其重要的意义。虽然动物模型可以反映人类的蛋白质降解过程的基本原理，我们还了解了不同哺乳动物在蛋白质特异性方面的适用性的困难和局限性。

 

 

简介：由于准确可靠的方法的局限性，死亡时间的测定（PMI）是法医的一个具有挑战性的工作。准确估计死亡时间对于刑法来说至关重要，因为它常常证明证人的陈述是正确的，特别是在多个尸体在时间接近的情况下，事件的连续信息往往是最重要的。虽然已有很多研究集中在PMI预测的新尝试和改进现有方法上，但符合实际要求的新的死亡时间估计方法仍然很有需求。在早期分解阶段，首先是物理变化，细胞破裂的影响，组织自溶活性和结构的改变可以被检测到。死亡期变化特征如尸僵（骨骼肌肉僵硬和松弛），尸斑（在身体下部的血液和血液制品的积累），尸斑（身体核心温度的变化）以及超生反应如响应电或药物激发适用于每天法医工作以估计死亡的时间。然而，这些参数是高度依赖于个人和环境因素，如温度，湿度，年龄，身体大小，死亡原因，或病理前提，一般仅限于早期死亡时间段（即，第一个36小时尸检，HPM）。在以后阶段的PMI估计通常更为困难，因为可用方法的范围要小得多。在死后阶段，从大约72HPM开始，法医昆虫学，尸体喂养昆虫的发育阶段的分析，有时可以提供有关最低PMI的信息。，但是，这种方法在许多情况下是有限的，例如昆虫可及性（在室内发现的尸体、被淹死的或覆盖的尸体等），或是某些不同物种发育的阈值温度。仅就生物医学数据（如尸检结果）而言，这几乎是不可能的，但通常仅限于其他信息来源，如现场发现的证据（电话登记、运输车票或报纸）、证词或供词。然而，这些数据高度依赖于案例，不能从一个传递到另一个。新的生物医学方法来解释这样的情况，因此在这一领域的额外研究是非常需要的。最近，一种基于骨骼肌蛋白降解的方法被用于PMI估计。在动物模型中观察到了10天的不同变化，并进一步证实了在法医学案例中的验证。与时间和温度显著相关的人类也有类似的变化。这一方法的第一次成功应用已经证明了在两种情况下进行比较的可行性，其中主要的影响因素（例如温度）可以排除在外。一般来说，由于不同的个体影响因素（如年龄、体重指数、死亡原因等）和PMI（温度、湿度等）的变化情况，在日常法医实践中获得的样本很难相互比较。为了描述生物过程的基本原理和某些影响因素，动物模型往往是不可避免的。然而，在没有进一步考虑和适当的比较研究的情况下，所获得的结果不能应用于人类病例，这是一项非常常见的任务，用于基础和应用研究的桥梁。特别是在法医科学中，猪通常被用作模型生物，因为它们的人体大小和生理学与人体相当，但需要大规模的实验装置和相应的设施。另一方面，啮齿类动物价格低廉，易于获取和处理，但提供的样品材料较少。为了评估这两种模型的合法性，并最终从两者的优点中获益，我们进行了一系列实验，比较了人类、猪和小鼠的蛋白质降解。此外，我们扩展了一组可能的靶蛋白来检测进一步的降解模式，从而确定了其他可行的死后间隔标记。

 

材料和方法：作为比较的标准，我们从我们的数据库中挑选了三个不同PMI的人类病例，以便能够说明可能的蛋白质带模式的多样性。由于没有本地样本可用，我们选择了一个小的PMI（0.5天尸检，DPM），以代表早期尸检阶段的情况下。该样本取自一位76岁的女性，她死于呼吸衰竭。中间PMI样本是一个82岁的女性，也死于呼吸衰竭和代表几天后发现的情况（2.5 DPM）。第三个样本是一个已经腐烂的尸体的（一个81岁的男子）。在这种情况下，应用任何现有的死亡时间估计方法都是不可能的。仅从法医调查收集的法医昆虫学和非生物证据，粗略估计了40个DPM。值得注意的是，蛋白质降解分析仍然揭示了特征蛋白谱。这些病例与先前研究中的猪样本进行了比较。最早的（0个DPM）、中间（2.5个DPM）和最后的PMI（10 DPM）。此外，我们从小鼠身上获取尸体肌肉样本作为试验方法来评估这种经常使用的模式生物的合法性。为了解释可能的早期蛋白质分解事件，正如他们在比较文献数据时所期望的那样，我们按照标准协议处理了0，0.8，1.5个DPM肌肉样本。分析之前，小样本（5×5×5毫米）是从每一个物种的大腿肌肉取样，被快速冷冻在液氮。对样本通过低温磨削和超声处理均质化。使用试剂盒检测蛋白质浓度，并用SDS-PAGE和Western印迹进行分析。总蛋白质的量分别适于每个物种获得可比的带强度。使用以下主要的抗血清：小鼠单克隆抗肌球蛋白，小鼠单克隆抗α-辅肌动蛋白，小鼠单克隆抗α-微管蛋白，小鼠单克隆抗快速骨骼肌肌钙蛋白T，小鼠单克隆抗粘着斑蛋白，小鼠单克隆抗结蛋白，小鼠单克隆抗心肌肌钙蛋白T和鼠单克隆抗波形蛋白。辣根过氧化物酶结合山羊抗小鼠多抗作为二抗。用ImageJ软件定量蛋白质条带。在PMI较高的样本中增加或消失的带信号被认为是退化事件。

 

结果：样品制备和处理方面没有大的差异，除了样品稀释获得相等的带强度。该协议可适用于任何经过测试的物种，这使得蛋白质降解谱的可比较性得到了合理的比较。原肌球蛋白降解分析产生的两个条带这在所有试验物种中都始终如一。这些带代表两个异构体，分子量约为36和38 kDa。这种稳定状态保持不变，不会失去任何降解产物的本带。在尸检蛋白质降解过程中天然α肌动蛋白（100 kDa）也保持稳定。同样，α-微管蛋白（55 kDa）的本带连续检测，然而，在人类样本中的强度非常低，即使在最高PMI样本中。显然死亡的早期阶段是由一个单一的本带（55 kDa的），而随后的降解产物约50 kDa，出现在人类和两种动物模型中。值得注意的是，这种降解产物在最小PMI人类样本中没有检测到。一个额外的降解产物52 kDa出现在中间小鼠样品。