摘要：兔子目前不是研究角膜内皮疾病的好模型。因为他们的角膜内皮细胞（CEC）保持高的增殖能力。本研究的目的是评估角膜内皮损伤后在离体兔前房内注射苯扎氯铵（BAC），研究旨在培养角膜内皮疾病动物模型最合适的起始剂量。

 

结果：经结膜入路摘除术获得40只兔的眼球，并根据注射的化合物分为8组：对照组（无注射），BSS，递增的BAC浓度（0.005%，0.01%，0.025%，0.05%，0.1%和0.2%）。在0, 6, 24和48小时，进行眼前节、视网膜镜和角膜镜的眼部检查，最后对角膜进行染色，并在光镜下观察角膜形态和死亡率。相比于BSS，角膜内皮细胞密度在0.025% BAC浓度开始明显下降，平均细胞面积、角膜水肿和角膜厚度分别在0.05%、0.005%和0.1% BAC浓度下显著增加。相比于对照组和BSS组，浓度为0.05%的BAC及以上引起CECs多形性和死亡率显著增加。

 

结论：体外实验前房注射BAC诱导兔角膜内皮细胞的毒性。然而，需要进行体内验证以建立所需的模型，其中0.05%的BAC是一个建议的起始点。

 

 

背景：角膜内皮（CE）是角膜内表面的一层细胞，其主要功能是控制角膜的水化，从而保持其透明性。CE有足够的角膜内皮细胞（CEC）并在整个生命保存这个功能，当CECs数量减少时，剩余的细胞反应增加它们的大小并改变它们的形态，但如果细胞丢失过大，这些代偿性改变是不够的，内皮细胞代偿失调发生。导致角膜水肿和部分或完全丧失角膜透明度。不幸的是，在人类体内的细胞增殖能力、灵长类动物和小动物是很有限的。在目前影响人类CE的疾病治疗中，已经描述了几种类型的内皮角膜移植技术，如弹力剥内皮角膜移植术（DSEK / DSAEK）及后弹力层角膜内皮移植术（DMEK）. 修复内皮损伤技术的理想动物模型应该在解剖学和生理学上与人体模型相似。猪、狗和猫是眼科研究中常用的动物模型，尤其是在视网膜研究中，但它们在角膜研究中并不常用。本文介绍了几种组织工程化CE的实验动物模型，包括猪、猫、猴、鼠、鼠和兔。由于它具有高可用性、低成本、体积小、操作方便等优点，在人类眼科学研究中得到广泛应用。目前，兔子不是研究CE疾病的好模型因为他们的细胞保持高的增殖能力。解决这一特殊特性可能会允许这种物种用于此目的。苯扎氯铵（BAC），季铵化合物，是最常用的眼用制剂中的防腐剂，浓度范围0.004%和0.025%之间。然而，兔体内高浓度的BAC对角膜有毒性作用，影响CE和其他眼部结构的完整性。此外，外用BAC可诱导泪膜干燥、角膜上皮增厚、杯状细胞丢失、结膜炎细胞浸润和增殖，结膜或小梁细胞促凋亡作用。在体内和体外兔前房注射BAC在之前已有报道。但据作者所知，前房注射BAC液对家兔CE的毒性作用尚未结合体外显微镜检查和活体染色评估。这项研究的目的是双重的。首先兔眼前房注射BAC评估血管内皮损伤，建立最合适的起始剂量以获得一种可重复的内皮疾病体内模型。

 

方法：动物和样品：该研究共纳入结膜入路摘除的40只兔眼，健康成年新西兰兔20只，性别不同、体重2至3公斤，年龄8到12周之间。无菌纱布放入无菌容器中，眼睛被放置在上面，5ml的冷却生理盐水溶液倒入并覆盖它，形成一个潮湿的环境。

 

初步评估：摘除6h内通过裂隙灯、角膜内皮显微镜和角膜厚度对其评估，在暗室中对所有的眼睛进行角膜和眼前段的眼科检查。只有无角膜和/或眼前段疾病的眼球纳入研究中（n = 40）。眼球放置在一个自制的甲基丙烯酸甲酯眼球放置器上，使用非接触镜面显微镜检查。所有的程序都由同一个研究人员进行，保持工作距离为25毫米。如果他们出现角膜失代偿，损坏的CEC，CEC的损失，或CE存在炎症细胞眼睛被排除在研究之外. 从角膜中央区域得到三显微照片。获得平均细胞面积和内皮细胞密度,测量中央角膜厚度。

 

前房内注射：选定的眼睛（n=40）根据注入物质被分为8组（n = 5）：对照组（注射）、BSS组和6个实验组（0.005%，0.01%，0.025%，0.05%，0.1%和0.2%的BAC）。研究中使用的不同的BAC化合物是在无菌条件下制备的。以BSS作为稀释剂。所有的前房内注射在角膜缘处由同一人在放大镜下使用27G针操作。注射后立即将针头取出。一滴或两滴房水可以被动地通过针头中心排出，然后将0.1毫升适当的化合物小心地注入前房。然后在注射部位用结膜钳施压20秒，以避免液体渗漏。

 

注射后的评估：在注射后6、24、48h对角膜进行观察。角膜水肿分级从0（无）-4（非常严重）。在整个实验过程中，眼睛被保存在4°C潮湿的室内。

 

角膜内皮细胞活体染色：注射后48h进行评估，角膜切除2 - 3毫米巩膜环。将内皮侧放置在聚四氟乙烯支架上，以减少起皱和变形。用台盼蓝和茜素红染色测定CECs损伤。将0.025mg台盼蓝放入10ml的0.9%生理盐水中制备0.25%的台盼蓝染液。将0.02mg茜素红粉稀释到10ml 0.9%生理盐水，制备0.2%茜素红染色稀释液。该制剂的pH调节至4.2，受损细胞可被台盼蓝染色，并呈深蓝色染色；茜素红允许CECs间边界的可视化，因为它们看起来是红色的。染色后，在光学显微镜下，对每个样品做了几个放射状切口，以便在检查前使角膜变平。并在40倍镜下对其进行观察，测量死亡率和多形性程度。对于细胞活力，如果核蓝染–表明CECs被灭活，如果核蓝染为33%或更少的比例，表明死亡率低。如果这个比例是34和66%之间，它被视为死亡率中等水平；如果死去的CECs率为67%或更高，表现为高死亡率水平。

 

结果：对照组（无注射）和BSS组比较，以观察是否前房注入BSS可以改变角膜本身。研究未发现有显著差异。与BSS组相比，0.005%、0.01%、0.025%、0.05%、0.1%和0.2%组角膜水肿明显增加。相比于BSS组， 0.025%组、0.05%组、0.1%组和0.2% BAC组的ECD显著降低。0.05%和0.2%BAC组的MCA显著增加。随着注射时间的推移，这些变化更频繁，而不论组别。

 

角膜厚度和染色：虽然随着时间的推移，所有组的CCT都有所增加，但与BSS组相比，在0.1%和0.2%组中，CCT显著增加。随着时间的推移，CCT和MCA增加，ECD减少。相比于控制和BSS组，0.05%及以上浓度BAC显著增加了死亡率和多形性细胞出现。活体染色也允许在CE上显示孔。

 

结论：本报告研究不同的BAC浓度兔眼前房注射后引起的血管内皮损伤。因此，鼓励它用于开发体内内皮疾病的动物模型，并建立0.05% BAC作为最合适的起始剂量。这些发现也提供了BAC对角膜的毒性作用的补充信息。