摘要：肾脏疾病是一个全球性的问题，仅在英国就有大约三百万人被确诊，而且发病率正在上升。研究开发更好的治疗方法是至关重要的。动物模型有助于更好地了解各种肾脏疾病背后的病理生理机制，以及筛选治疗性化合物，但是，尤其是哺乳动物模型的使用应尽量减少，以利于动物福利。斑马鱼越来越多地被使用，因为其具有肾脏肾小球滤过和管状滤过处理的基本肾脏解剖结构。在这里，我们将讨论斑马鱼如何促进肾脏病和肾脏疾病机制的研究。

 

 

简介：肾脏疾病是一个全球性的问题，仅在英国就有大约三百万人确诊，但仍多达一百万人未确诊。肥胖、糖尿病和高血压等因素对肾功能不全起到了一定的作用。但是仍需要更多的研究来了解疾病背后的病理生理学。动物研究是研究的主要工具，能更好地理解正常生理和疾病机制，并测试潜在的治疗方法。斑马鱼已被确立作为发育和繁殖研究的模型。但是，技术的进步促进了斑马鱼作为研究器官特异性疾病（如肾脏疾病）模型的发展。斑马鱼胚胎在发育的早期阶段（受精后5天）被认为没有什么痛苦，因此不受动物实验规程的保护，从而使它们成为哺乳动物模型（如小鼠和大鼠）的有用替代模型。斑马鱼精子也可以冷冻保存，减少对活体培养的需要，从而减少资源的使用。斑马鱼比哺乳动物模型（如小鼠）具有优势。能够产生大量（50-200）的后代，并在3个月内能长到成年。这使得各种化合物的测试，甚至药物筛选是可行的，潜在的高通量。由于透明性，这些胚胎可以被快速地分析为一种感兴趣的表型，并且可以通过化学处理和白化菌株来减少色素，从而使后期的表型分析成为可能。因为它们非常适合遗传操作，如在生命的一个细胞的阶段通过显微注射DNA和RNA，来进行遗传性疾病的研究。人类和斑马鱼蛋白之间的功能域具有很高的保守性，至少70%的斑马鱼蛋白同人类同源。长期以来斑马鱼被用于其他研究领域，以更好地了解各种疾病状态。例如，通过使用化学物质，可以在许多器官中诱导肿瘤，证明这些模型是有用的癌症模型。

 

斑马鱼模型的概况：正向和反向遗传方法可以很容易地用于斑马鱼基因研究。正向遗传学方法涉及胚胎的随机突变，改变基因功能，并以表型作为寻找致病基因的起点。斑马鱼的筛选是可行的，首次用于鉴定脊椎动物发育的基因。他们也成功分离出人类疾病的候选基因。与反向遗传学相反，这是一种无偏见的方法，其中一种特定的基因被打乱以研究对胚胎的影响。这里描述了可以用于斑马鱼的各种遗传操作的摘要：

 

瞬时基因抑制：吗啉代  另一个工具是吗啉代这些靶向反义寡核苷酸都是自20世纪90年代以来常用的碱基修饰寡核苷酸，瞬时敲除感兴趣的斑马鱼基因。在2000年首次用于斑马鱼，具有特异性地阻断感兴趣的mRNA转录物的优点，具有更高的效率。它们是在没有基因突变的情况下研究特定基因或多个基因的第一种方法。

 

正向遗传：  随机突变，插入诱导突变。

反向遗传 ： 靶向诱导的基因组局部病变，靶向基因胚系突变。

 

斑马鱼肾脏与哺乳动物肾脏：斑马鱼是一种淡水鱼，斑马鱼肾脏的主要功能是排泄水和维持渗透压调节。然而，斑马鱼与哺乳动物肾脏之间有着密切的功能相似性，这使斑马鱼成为肾脏研究的极好模型。斑马鱼可能是一个研究如肾小球滤过和肾小管清除过程的有用有机体。斑马鱼前肾是由两个肾单位起源于中胚层，类似于哺乳动物的肾脏。两侧的原肾管与肾小球相连位于胚胎中线。原肾管由上皮细胞排列形成从肾小球到泄殖腔，类似于哺乳动物系统，如肾小管近端和远端。在哺乳动物肾脏中定位于特定节段的许多基因也在斑马鱼中表达。例如，溶质转运SLC9A3和SLC4A4被限制在斑马鱼和哺乳动物近端表达和clcnk编码哺乳动物中的氯离子通道在远端区域表达。像人类一样，斑马鱼具有发达的刷状缘膜，也表达megalin和cubulin受体位于近曲小管段，有利于盐、糖和小蛋白的再吸收。斑马鱼的肾小球解剖结构与人肾小球相似，另一个区别是，斑马鱼有中肾而不是成人的后肾，没有膀胱。此外，与哺乳动物肾结构略有不同，例如没有近直小管和升支粗段。

 

肾脏发育：肾脏发育也有相似之处：斑马鱼的基因如pax2.1（高等脊椎动物肾脏发育必不可少）也指导肾发育而导致上述管状分割。斑马鱼蛋白cadherin17，同源的人类LI-钙粘蛋白（CDH17），确保顶端和基底膜域的发育和和细胞衔接管内的发展。Notch信号通路已被证明作为配体在肾单位的发展起着重要的作用，如deltaC，jag1b和jag2a，限于近端中胚层。前肾的定位和分割是通过转录因子（尾）CDX介导，通过增加胚胎轴影响视黄酸活性然后形成肾。通过对视黄酸和irx3b信号通路模式研究，斑马鱼提供了一个洞察肾单位分化的窗口。吗啉代敲除受精后72h斑马鱼胚胎irx3b基因显示一个成熟的远端的缺乏以及近端小管边界扩张和水肿。有趣的是，相对于人类，斑马鱼还能开发新的肾单位，应对肾功能的损伤。通过研究斑马鱼肾发育，研究人员可以检测肾发生作用的分子途径，随后可以在小鼠模型的进一步研究。许多斑马鱼突变株今天存在于生物医学研究中，用于研究肾脏功能，并将研究结果与人类肾脏联系起来。例如，TG斑马鱼线，通过绿色荧光蛋白（GFP）使近端肾小管和肾小球荧光可视化，用于显示的肾母细胞瘤蛋白（WT1）在斑马鱼肾小球形成和生长过程中的重要性。突变的WT1基因可以导致肾母细胞瘤、小儿肾脏癌。

 

功能试验研究肾功能：还有其他工具可以用来研究肾功能。考虑到肾脏排泄水的重要性，突变鱼水肿的存在可能是肾功能受损的一个标志。斑马鱼模型通常很难检测尿液中的变化，以评估特定标记物的清除因为它周围的水环境，而不是纯粹的尿液。常规的肾功能检查在临床上是很有挑战性的，因为尿量很小，而且尿液会被释放到周围的水中。这可以限制斑马鱼作为特定管状疾病模型的效用。荧光分析在研究斑马鱼肾功能和疾病模型方面是有用的。通常，在斑马鱼胚胎中注入荧光示踪剂，以便于在感兴趣区域内在荧光显微镜下跟踪它们。大分子量示踪剂保留完整的肾小球屏障，因此可以用来研究肾小球功能。转基因株系的开发是为了表达维生素D结合标记的绿色荧光蛋白。当与另一个足细胞损伤的转基因株系杂交时，双转基因鱼显示积累的vdbp-gfp在近端小管，显示肾小球滤过屏障（GFB）受损。低分子量荧光示踪剂的消失率可作为肾小球滤过率的粗略标志。这种技术可以全面地使用斑马鱼胚胎和肾脏，通过可视化荧光显微镜来实现。肾小球滤过功能受损将导致鱼葡聚糖保留，并可以可视化和测量。我们受损的肾清除标记罗丹明葡聚糖分子量为10 kDa，当注射到胚胎的心包。鱼的荧光损失与葡聚糖的肾脏清除有关。示踪剂还可以用来评估肾小管功能，特别是近端小管回吸功能。斑马鱼肾小管功能的另一个重要方面是水的排泄。因此，肾小管转运蛋白缺失可导致水潴留，正如我们在上述情形显示出扩张的原肾管和心包水肿。

 

斑马鱼作为肾小球疾病模型：在一项研究中，两种候选蛋白，SOS RAS /鸟嘌呤核苷酸交换因子2（SOS2）和酸性磷酸酶1（ACPI），被预测要涉及的早期肾脏的发育和功能的基础上估计肾小球滤过率（eGFR），血清肌酐值和变异基因。评估罕见变异对慢性肾脏病的影响。当吗啉代被注入到斑马胚胎，肾小管出现形态学改变，如伸长、胚胎的体长减少。为了确保这些变化不是由于脱靶效应造成的，针对"ATG的吗啉代的起始位点与剪接位点的吗啉代验证也表现出类似的表型，如体长减少。72h的胚胎也显示水肿，用70 kDa的罗丹明标记葡聚糖测定肾小球功能和肾小管流量，与对照组相比显示葡聚糖清除减少。这种表型也与SOS2、ACP1在肾脏发育的作用有关。磷脂酶C epilson突变基因（plce1），其正常功能是启动细胞生长、分化和基因表达，导致早发性肾病综合征和终末期肾病。斑马鱼plce1蛋白高度保守，便于研究人员探讨PLCE1在足细胞中发挥的功能。

 

急性肾损伤：斑马鱼也被用来研究肾毒性药物如顺铂、庆大霉素效果。这些药物的使用会导致胚胎水肿，以及组织学改变，如刷状缘扁平化和管状管腔内出现碎片。最重要的是，在这些药物治疗的斑马鱼体内注射示踪剂，如葡聚糖和菊粉，显示肾小球滤过率受到干扰，因为清除率相对于对照组有所下降。E3泛素连接酶，小鼠双微体（MDM2）基因，调节p53的诱导，是炎症的启动子。它对于维持肾小管上皮细胞的平衡也是很重要的。目前正在研究MDM2抑制剂作为抗癌药物，通过thomasova等人最近的一项研究。对肾小管上皮细胞有保护作用，对急性肾损伤有保护作用。

 

肾小管功能：尽管斑马鱼在管状疾病的研究中有局限性，但他们也被用来研究肾小管相关的疾病。多囊肾疾病：鉴定了12个具有囊性肾脏表型的斑马鱼突变致病基因，对12个基因的同源基因，肝细胞核因子1（HNF1）和多囊肾2（PKD2）与人类多囊肾疾病有关。多囊蛋白突变（PC），多囊性肾病1和2（PKD1和PKD2），引起人类常染色体显性遗传性多囊肾病. 囊肿形成包括两步， PKD在上皮细胞的胚系突变和体细胞突变，导致了这些细胞的增殖，并导致囊肿和管状扩张的形成。通过注射外源基因或DNA，斑马鱼胚胎中过表达C-末端多囊蛋白片段，表现出肌肉和原肾管发展组织被破坏。研究表明，多囊蛋白-1调节Wnt信号转导通路，肾小管发育至关重要的阶段。斑马鱼也提供了在Nek家族激酶突变的跨物种保护，引起小鼠连接节和皮质集合管的囊肿形成。Nek8与多囊肾疾病相关。使用吗啉的方法在斑马鱼胚胎中注射NEK8反义序列导致受精后48h斑马鱼出现囊性肾脏。

 

终末期肾病与载脂蛋白1：载脂蛋白1（APOL1）的突变已被证明能能增加发展为终末期肾病（ESRD）的风险。肾脏再生功能：斑马鱼也被用来研究功能丧失后再生的可能性。结果表明，肾祖细胞能在成年斑马鱼产生新的肾单位。此外，利用转基因株系的TC、TG，研究人员能够跟踪庆大霉素诱导的肾损伤后肾再生的时刻。一个表达WT1基因的同源基因，wt1b，影响肾损伤4天的成年斑马鱼，新的早期祖细胞向1期肾单位原基发展。

 

结论：我们可以利用斑马鱼来研究靶基因突变对肾脏生理功能的影响，根据遗传相似性利用这些知识来帮助了解更多基因对人类的影响。有针对性的种系突变，我们也可以评估特定突变的效果，以评估肾病患者遗传变异的致病性。斑马鱼也可以用来研究肾脏的基本生理。总的来说，斑马鱼是研究肾功能和疾病的一个有用的模型。