选择性的组织蛋白酶K抑制剂MIV-711减轻骨关节炎动物模型关节病理

来源:Journal of Translational Medicine December 2018, 16:56 | Cite as 发布时间:2018年03月21日 浏览次数: 【字体: 收藏 打印文章
摘要:MIV-711是一个高度有效的和有选择性的组织蛋白酶K抑制剂。本文总结了兔前交叉韧带切断(ACLT)关节病理MIV-71疗效和犬半月板部分切除关节病变的MIV-71预防作用。
 
方法:术后1周开始每天服用,兔每日口服MIV-711或赋形剂(n=7/周)连续7周。四组分别为:(1)假手术+赋形剂组;(2)ACLT手术+赋形剂组;(3)ACLT手术+MIV-711,30umol/kg组和(4),ACLT 手术+MIV-711,100umol/kg组。通过CT、骨组织形态计量学测定软骨下骨和关节软骨的结构,和得分。半月板部分切除的狗从术前一天开始接受灌胃MIV-711,30umol/kg或赋形剂(n=15/组)连续28天。在宏观和微观水平上评估软骨降解。在两项研究中测量MIV-711,评估骨吸收和软骨降解。
 
结果:在ACLT组,相比于赋形剂对照组,MIV-711将HP-1水平降至72%,将CTX-II水平降至74%。ACLT术后明显减少软骨下骨板的总厚度,减少股骨和胫骨骨小梁体积。这些改变被MIV-711逆转。ACLT导致软骨增厚,该症状被MIV-711逆转。MIV-711不影响骨赘形成或Mankin评分。犬,MIV-711降低CTX-I和CTX-II水平分别为86%和80%。滑膜CTX-II水平较基线减少55-57%。MIV-711给药组股骨髁部宏观评分下降25-37%,胫骨下降13-33%。
 
结论:MIV-711防止两骨关节炎动物模型软骨下骨损失和部分减轻软骨病理。MIV-711对关节病理与减少骨和软骨的生物标志物的有益影响,已被证明在临床上是可以实现的。数据支持MIV-711进一步发展为骨关节炎的治疗。
 
关键词:组织蛋白酶K  骨关节炎  HP-1  CTX-I  CTX-II  软骨下骨  软骨
 
背景:骨关节炎(OA)是一种常见的肌肉骨骼疾病,以关节结构的损伤为特征,导致关节僵硬和疼痛等症状。骨关节炎影响整个关节,包括软骨和软骨下骨变性和滑膜炎症。该病以软骨退化为特征,软骨下骨在骨关节炎的发生和发展中的作用近年来受到越来越多的重视。高水平的软骨下骨移位预示着骨关节炎患者术后关节间隙变窄。骨磨损,反映软骨下骨丢失和压扁,可能是由于骨量不足,同骨髓病变,软骨损伤和结构异常等相关。软骨下骨的改变似乎发生在OA早期,可能先于软骨损伤。然而,人们也清楚地认识到,软骨下骨和关节软骨之间存在广泛的相互作用,早期的生物力学变化可能影响到另一个相对应部位。 组织蛋白酶 K主要由破骨细胞表达,是通过I型胶原裂解参与骨吸收的关键酶。组织蛋白酶K也在软骨中的软骨细胞中表达,它可以切割蛋白多糖和II型胶原,软骨基质的主要成分。例致密性成骨不全症,疾病通过抑制组织蛋白酶K基因突变引起的,表现出异常的致密骨(骨硬化症),这种效应在缺乏组织蛋白酶K的转基因小鼠中得到了再现。选择性组织蛋白酶K抑制剂增加绝经后骨质疏松症及绝经后骨质疏松症患者骨密度。最先进的组织蛋白酶K抑制剂odanacatib在三期临床研究中减少绝经后妇女椎骨和髋部骨折的发生率。虽然大量的研究已经证明组织蛋白酶K抑制剂可以对骨质疏松骨产生有益的作用,但组织蛋白酶K对软骨下骨和关节软骨的作用却知之不多。在关节退化的临床前模型中可用的数据支持组织蛋白酶K在疾病过程中的积极作用,实验性组织蛋白酶K抑制剂的研究证实了这一点。组织蛋白酶K抑制剂sb553484,尽管存在选择性差,对半月板部分切除的狗发挥软骨保护作用。选择性的组织蛋白酶K抑制剂l-006235逆转前交叉韧带切断(ACLT)兔软骨下骨丢失。然而,这两种化合物都没有进展到临床发展。MIV-711是一种目前用于二期临床OA治疗的强效和选择性蛋白酶K抑制剂。膝关节骨关节炎患者接受一次6个月MIV-711日常处理显示关节结构益处,与接受安慰剂的患者相比,磁共振成像(MRI)评估病变膝关节软骨变薄。本文总结了MIV-711对ACLT兔关节和部分半月板切除犬的病理影响。用于动物模型MIV-711剂量产生的临床相关风险被认为是安全的。
 
方法:兔前交叉韧带切断术(ACLT):雄性新西兰兔,32只,实验开始时,动物大约9个月大,体重3.7 - 4.5公斤,根据体重随机分为四组。术前静脉注射布托啡诺(0.5-1毫克/公斤,肌肉注射)镇痛,诱导前15min,给予格隆溴铵(0.1mg/kg)。氯胺酮(20-40毫克/公斤,肌肉注射)和甲苯噻嗪(5-10毫克/公斤,肌肉注射)混合麻醉,其次是放置气管导管。异氟醚维持全身麻醉。围手术期头孢唑啉(40毫克/千克,静脉注射)给药,气管拔管后,给予yobine逆转甲苯噻嗪。芬太尼贴片(25 ?g/h)被放置在皮肤的切口区域以提供术后镇痛。在无菌情况下,右膝内侧的切口为1.5 - 2.5厘米。髌骨横向脱臼,膝关节完全屈曲。暴露前交叉韧带(ACL),并被适当的刀片切断。假手术组动物,暴露ACL但不切断。关节用无菌盐水冲洗并关闭。缝合肌肉和皮肤,用外科胶闭合。环丁笄吗喃(0.5-1毫克/公斤,肌肉注射)提供术后镇痛,将动物单笼放置。
 
实验设计和样品收集:假手术组及ACLT术后一周,动物口服MIV-711或赋形剂,连续7周,剂量4ml/kg。四组分别为:(1)假手术+赋形剂组;(2)ACLT手术+赋形剂组;(3)ACLT手术+MIV-711,30umol/kg组和(4),ACLT 手术+MIV-711,100umol/kg组。剂量和给药间隔是基于正常新西兰兔组织蛋白酶K效价和药代动力学。选择兔ACLT研究剂量旨在与人类耐受性良好的暴露范围相同,有效地减少健康受试者骨吸收和软骨退化的生物标记物。十二份各1毫升血液标本,从每个动物以覆盖尽可能多的时间点以交错的方式收集MIV-711浓度进行测定。血样采集于第1天、第10天和第4周和第7周。样品在EDTA涂层管中收集并保存在冰上。通过离心分离血浆(2000g 4°C 3-5分钟),然后冷冻保存在-70°C直到分析。所有动物在手术前收集尿液,在手术前、第1天、第10天和第4周和第7周给药前进行生物标记测量。尿液储存冷冻(-70--80°C)直到分析。
 
微型计算机断层扫描(uCT):从所有的动物股骨和胫骨进行uCT扫描,分别观察骨和软骨。用36μm的各向同性体素分辨率获得300毫秒的曝光时间、2000个视图和1帧的图像数据。每个样本扫描两次,一次用于获取骨数据,一次用于软组织数据。骨扫描后,使用Hexabrix对膝盖染色软骨对比增强成像。VHLab为每个样本的股骨和胫骨分割出感兴趣区域(ROI)(骨赘、软骨和软骨下骨)。一个跨越9毫米的股骨关节面和6.5毫米的胫骨区域被选定为分割软骨和软骨下骨的前后方向。然后将体素计数乘以立方体素分辨率,以获得不同ROI的体积测量。计算从骨到关节软骨外表面的距离。生成一个图像,将距离转换为彩色地图,以观察沿软骨长度的厚度。
 
犬半月板部分切除手术:30只成年雌性比格犬,重量7.5-11.3kg,约6-8月龄,在开始研究之前,这些犬至少驯化了7天。手术前至少12小时,将芬太尼透皮贴剂2.5毫克贴片放在每只狗的尾部腹侧皮肤上,并用胶带固定到位。芬太尼贴剂的镇痛持续时间为72~80小时,镇痛效果约为25μg/h。术前皮下给药胃长宁(0.005-0.02毫克/公斤),乙酰丙嗪(0.01-0.05毫克/公斤)和吗啡(0.5-1.0毫克/公斤)。麻醉诱导采用丙泊酚(2-6 mg/kg)静脉注射;每只犬进行气管插管,并使用异氟烷维持麻醉。剃除术部的毛发,并用含洗必泰的无菌纱布进行擦洗。在切口处注入利多卡因和布比卡因(1.5毫克)的局部麻醉阻滞,以提供局部麻醉。铺设洞巾,进行手术。进行2厘米内侧髌旁切口,并暴露半月板。去除内侧半月板的前半部分,切开内侧副韧带,去除半月板附件,造成关节软骨损伤。用止血钳止血,半月板损伤是内侧副韧带切除造成的。通过半月板进行全厚度切割,消除约1/2的半月板。滑膜和皮肤缝合关闭。动物在整个恢复期和术后期间都受到密切监视动物发声,运动,搅拌观察,心率和呼吸率。约72h后去除芬太尼透皮贴片。芬太尼贴剂去除后,没有狗出现非负重跛行。
 
实验设计和样品收集:每天早晨犬接受30ug/ml的MIV-711或赋形剂(n=15)。剂量和给药间隔MIV-711是基于对狗MIV-711组织蛋白酶K酶效价的选择(KI = 1.5 nmol / L)和正常犬PK。手术的前一天开始给药,持续28天。每只狗在给药前至少禁食12h,并在给药后4h给予食物。为评估MIV-711的暴露量,在给药后1、7、28天收集血液。口服药物前和口服药物后1、2、4、8和24h给药。样品30min内在2-8°C,3000g离心10min,分离血浆和存储在?70°C直到分析。在手术前尽量收集较多犬的滑膜液,将其同手术和手术的对侧膝盖滑膜液进行对比。使用注射器直接取样。滑膜液被转移到含有EDTA的试管中。样品离心,收集上清液并存储在?70°C,直到分析。术前1~3天,治疗前(基线标本),治疗后4~7天(第7天),治疗后26~28天(第28天)采集尿样。通过代谢笼收集,如果没有收集到尿,辅助排尿,收集量15ml。2-8°C约3000转离心尿10分钟。收集尿上清液并存储在?70°C直到分析。
 
宏观评分:所有动物在第29天,给予安乐死。注射乙酰丙嗪用于镇静,注射戊巴比妥钠(大于等于88mg/kg)进行安乐死。打开左膝盖,测量、描述和拍照脱节和病变的内侧胫骨和股骨。使用照片来确定每个胫骨内侧病变面积百分比。对总软骨病变进行测量(长度×宽度)和描述为浅,中,深。根据病变的测量,对胫骨内侧和外侧的股骨头进行了大体的主观软骨退变评分:0:正常,1:表面变性达10平方毫米,2表面变性大于10平方毫米,3:中度退化达15平方毫米,4:中度退化大于15平方毫米。各区域的主观评分被用来为每个动物的每个区域产生一个主观的软骨退变的总体指数。软骨病变实际测量基于长度×宽度×深度得分来推导:(1=轻度,2=中度,3=重度)。
 
评估生物标志物和MIV-711暴露:常规CTX-I实验来评估骨吸收。测定家兔和犬尿的CTX-I(I型胶原羧基末端肽)和CTX-II(II型胶原羧基末端肽)。测定家兔尿螺旋肽(HP-1)浓度。测定犬滑液CTX-II水平。
 
结果:MIV-711对兔ACLT模型的影响和MIV-711在兔体内的药代动力学研究:单次给予MIV-711 分别30和100 umol/kg,Cmax分别为0.25和1.8umol/L。低、高剂量组0-24 h相应的曲线下面积(AUC)分别为0.78和7umol H/L。
 
MIV-711对骨吸收标志物HP-1的影响:在手术后7天,假手术对照组HP-1水平增加约1.8倍。相比于基线值,手术后ACLT兔尿HP-1水平增加2.3-2.4倍。给药后10天,ACLT+赋形剂组HP-1水平比假手术组增加。MIV-711给药4周后,ACLT和假手术组动物HP-1水平相似。
 
MIV-711对软骨降解生物标记物CTX-II效应:基线尿CTX-II水平相似。整个实验过程中,假手术组和ACLT动物尿CTX-II水平相似。MIV-711剂量依赖性地降低CTX-II水平。
 
MIV-711对软骨下骨结构的影响:术后MIV-711明显减少股骨软骨下骨板的总厚度。.接受MIV-711的两组骨板的总厚度同假手术组一致。
 
MIV-711对对关节软骨的结构的影响:ACLT导致关节软骨增厚,特别是在后内侧髁软骨,而一些地区呈局灶性软骨变薄或完全侵蚀,特别是在内侧髁下方面。MIV-711衰减ACLT诱发增加软骨肿胀。
 
MIV-711对犬部分半月板切除模型的影响 :MIV-711对生物标志物的影响:MIV-711降低CTX-I和CTX-II水平。
 
结论:选择性的组织蛋白酶K抑制剂MIV-711减轻OA实验模型关节病理和减少骨吸收和软骨退化的生物标记物。同人类似的暴露和生物标志物水平的变化支持MIV-711作为潜在的关节炎治疗药物。
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