背景：胃癌（GC）是最常见的癌症之一。由于它的异质性和有效的药物靶点少，GC仍然是精密医学中最难探索的领域之一。本研究我们旨在基于斑马鱼胚胎模型建立体内衍生异体移植瘤（PDX），允许快速分析血管生成和侵袭潜能，以及快速的药物敏感试验。

 

方法：两人胃癌细胞株移植到斑马鱼胚胎，在体外和体内测试了它们对5-FU的敏感性。胃癌组织中的十四个原代细胞被移植到斑马鱼胚胎中，对其增殖、血管生成和转移活性进行了体内评价。测试了对5-氟尿嘧啶（5-FU）、多西他奇、阿帕替尼的敏感性。

 

结果：体内和体外，SGC-7901对5-氟尿嘧啶（5-FU）的敏感性均高于AGS。十四例患者中有九例成功移植于斑马鱼胚胎，均表现为活胚胎增殖、血管生成和转移潜能。四例对三种化疗药物敏感性不同。

 

结论：我们的斑马鱼PDX（zpdx）模型是一种可靠的用于胃癌体内临床前模型。斑马鱼PDX也是一个很有前景的针对胃癌翻译研究和实施个性化治疗的平台模型。

 

 

背景：来自患者的移植（PDX）模式已成为近年来流行的比一种异种细胞模型（CDX）更有优势的模型。它密切概括患者原发肿瘤的异质性和稳定性具有生物基因的表达和突变状态。越来越多的证据表明，PDX模型真实地模拟病人的肿瘤生物学，直接比较患者及其相应移植瘤的药物反应预测病人的药物反应。大多数PDX模型通过皮下移植病人的肿瘤组织到NOD/SCID小鼠建立。已经建立各种小鼠肿瘤的PDX模型，包括结肠癌，乳腺癌，非小细胞肺癌，肾细胞癌和胃癌的研究肿瘤生物学和药物筛选。然而，相关的成本是巨大的，完成这些研究所需的时间可能是广泛的。斑马鱼是一个强大的研究人类恶性肿瘤的模型。它与哺乳动物的生理和遗传相似性很高，与临床环境密切相关，并能监测肿瘤的自然病史。透明胚胎显示出明显的特征，有助于肿瘤的发生发展、血管生成、侵袭和转移，是一种很有前途的异种移植肿瘤模型。近年来，斑马鱼PDX模型的价值已经出现了。本文的目的是描述一个新的GC体内zpdx模型。该模型可用于研究肿瘤血管生成、细胞侵袭和药物反应，省时省力。重要的是，这项工作揭示了zpdx模型作为体内的第一平台，实施个性化GC治疗。

 

方法：斑马鱼饲养：转基因斑马鱼TG（FLI-1：EGFP）在内皮细胞表达增强型绿色荧光蛋白（EGFP）。饲养在28.5°C。光暗周期14:10 h. 将2条雄性和2条雌鱼混合在装有网格的水箱中，以避免对新产卵的卵子进行捕食。受到光的刺激鱼交配后产卵。在含有胚胎培养基的培养皿中收集胚胎并放置于28.5℃。产生的整个胚胎被汇集、计数，而畸形胚胎被丢弃。产卵受精率较低（＜85%）或频繁发育异常（> 5%）不使用。胚胎的年龄表示为受精后小时（HPF）。

 

细胞培养与原代组织分离：胃癌细胞系AGS和SGC-7901在添加10%的胎牛血清、100 U/ml青霉素和链霉素的RPMI 1640培养液中培养，通过肿瘤分离试剂盒分离组织标本中的原代单个细胞。

 

体外细胞活力测定：采用细胞计数法测定细胞存活率。对数期细胞接种于96孔板中。过夜培养后，更换含5-FU的新鲜培养基培养72h，用新鲜培养基培养的细胞作为对照组。随后，10ul CCK8溶液被添加到每孔，与细胞同孵育2h。使用微孔板读数测定450 nm处的吸光度。对照组的吸光度作为100%细胞活力。结果以吸光度的百分比表示。确定50%的抑制浓度。所有实验均一式三份，独立实验至少重复四次。

 

细胞标记、异种移植和计数程序：AGS和SGC-7901细胞株、原胃癌细胞带有CM-DiI荧光标记。标记细胞用PBS洗两次，用含10%血清的RPMI1640培养基中悬浮，浓度2×107细胞/毫升。注射前用台盼蓝染色观察细胞活力。GC细胞系细胞活力高于95%，原代GC细胞为70%。转基因斑马鱼胚胎TG在受精后24h，用1毫克/毫升蛋白酶去除卵壳。去除卵壳后，胚胎浸泡在含0.2mM 的PTU胚胎培养液中，28.5°C放置24h。48 HPF， 0.0003%三卡因麻醉胚胎，定位在右侧的湿琼脂糖垫上。细胞系约200 - 300个细胞和大约600-800个原代细胞在观察镜下用微量注射器注射到斑马鱼胚胎卵黄囊中。移植后，胚胎在28.5°C孵育1小时。检查卵黄囊存在的细胞和循环系统中没有细胞。然后胚胎在32度孵育以下天数。一组牺牲10个胚胎，并解离成单细胞悬液，CM-DiI标记细胞数是胃癌细胞基线数与赋形剂或药物治疗前确保细胞在斑马鱼胚胎内移植和增殖。确认在指定时间点的人类癌细胞计数，排除组织碎片的非特异性染色。

 

异种移植模型的药物浸泡和显微注射：浸泡给药，将药物放置到水中暴露给幼虫，移植斑马鱼胚胎72h时随机转移至24孔板中，每孔10个胚胎，含0.5ml胚胎培养液含不同浓度药物（多西他奇和阿帕替尼）孵育48 h。用0.1%的DMSO处理斑马鱼胚胎作为赋形剂对照组。在黑暗中恒定的温度（32度）进行试验。微量注射给药，用胚胎培养液稀释药物（5-FU）注射到卵黄囊。在注射前，受精后72hpf胚胎三卡因麻醉，放置在右侧的湿琼脂糖垫上。10纳升药物按照药物注射到胚胎的卵黄囊中。将注入的胚胎随机转移到24孔板上。每孔10个胚胎加0.5毫升胚胎培养液，给药48小时。斑马鱼胚胎给药10纳升的培养液作为赋形剂对照组。血管生成的观察，异种移植的胚胎用50nM VRI 药物浸泡6h，32度孵育，在受精后72h拍摄照片。

 

成像：倒置荧光显微镜下，在注射后1、4、7天观察肿瘤细胞生长和迁移。共焦显微镜下观察血管再生。如果标记的胃细胞在卵黄囊区域以外被识别判定为细胞迁移。

 

免疫组化：注射胃癌细胞的7d胚胎，4%多聚甲醛固定，脱水，石蜡包埋，切片。切片HE染色，用倒置荧光显微镜获取图像。

 

结果：AGS和SGC-7901细胞系诱导斑马鱼胚胎血管生成。注射AGS和SGC-7901的细胞系最早在注射后1d显示促血管生成的行为. VRI,一种吡啶基邻氨基苯甲酰胺化合物显示强烈的VEGFR-1和2的激酶活性的抑制作用可以阻断AGS和SGC-7901诱导的血管生成。

 

体内和体外SGC-7901比AGS显示对5-FU的高敏感性：体外药敏试验，5-FU对细胞的存活率有显著的抑制作用，且呈剂量依赖关系。

 

病人来源的胃癌样本形成腺样体结构，诱导血管生成和转移特征。64%的GC病人样本显示移植成功。

 

结论：研究表明， zpdx模型的适用性作为翻译研究的一个创新平台，包括肿瘤微环境相互作用、生物标志物发现和药物筛选等。未来使用更大的样本量着重研究其在GC治疗决策中的潜在效用。