摘要:调查使用II型胶原酶诱导角膜膨隆兔模型。
方法:十只新西兰白兔右眼作为实验组。左眼作为对照组。上皮清创后,II型胶原酶溶液(200μl ,5mg/ml)室温(24°C)下应用于实验组30分钟。200ul不含胶原酶的溶液应用于对照组。在手术前后裂隙灯显微镜检查、测量平均角膜曲率(KM)和中央角膜厚度(CCT)。第14天获得角膜进行生物力学评价。
结果:术后无明显炎症反应。实验组与对照组相比,第7天和14天时,平均角膜曲率(KM)显著增加,有统计学意义分别为(1.54±1.29 D,vs. 0.82±0.44 D,0.89±0.89D,vs. 2.11±1.02D)。实验组与对照组相比,第7天和14天时, 中央角膜厚度(CCT)显著减少有统计学意义,分别为(23.10±12.17 μm vs 6.20±16.51 μm,16.10±10.46 μm vs 11.60±0.88 μm)。实验组在5%、10%、15%和20%变形时的平均应力和弹性模量降低,,两组间的弹性模量差异在10%和15%处差异有统计学意义。
结论:II型胶原酶导致模拟角膜曲率,角膜曲率增加,角膜变薄,弹性模量降低。用胶原酶II治疗可产生角膜膨隆症的动物模型。
关键词:圆锥角膜 角膜膨隆 II型胶原酶 动物模型
背景:圆锥形角膜(KC)是一种非炎症性、渐进性的膨隆性疾病,它通常是双侧的,其特征是角膜变薄、瘢痕形成、根尖突出和不规则角膜地形图。KC是世界上常见的一种临床疾病,其发病率约为每2000例出1例,无性别或种族倾向。这种疾病通常是从青少年时期开始的,而且通常进展到中年。KC通常导致近视和散光引起的渐进性视力损害。它是发达国家角膜移植最常见的病症。因此,KC已成为眼科广泛的临床和基础研究的焦点。KC确切的病因仍然是未知的,它可能涉及遗传和环境因素。KC的治疗方法包括隐形眼镜、硬性透气性透镜、角膜胶原交联、环内环段插入和角膜移植。了解疾病发生和发展的过程有助于检测KC的病因和治疗方法。作为基础研究的一个有价值的和不可缺少的工具,体内动物模型可以使研究者更好地了解KC的病理生理学,并验证发病机制的假说,以及评估潜在的治疗方法。然而,没有合适的KC动物模型是可用的,这可能是由于其复杂的和未知的病因。因此,需要一种能够重现这种疾病的病理生理特征的动物模型。KC是最常见的角膜膨隆障碍,因此建立角膜膨隆模型来模拟KC是很重要的。角膜屈光手术去除角膜组织破坏角膜生物力学,降低胶原拉伸强度。准分子激光原位角膜磨镶术(LASIK)在动物角膜,尤其是兔角膜上的应用是最常见的角膜扩张动物模型。然而,LASIK后扩张和KC在组织病理学和超微结构上可能不同,因此LASIK后扩张模型不是理想的圆锥角膜动物模型。降解酶如酸性酯酶、酸性磷酸酶和组织蛋白酶B和G之间的不平衡,以及它们的抑制剂如角膜抑制剂和巨球蛋白被认为与KC有关。研究表明,在这种疾病期间,基质中胶原含量降低。胶原酶活性在器官培养的KC角膜中增加,这导致局部胶原酶应用可用于产生角膜膨隆模型的可能性。Hong等人报道了外用胶原酶后角膜供体角膜曲率显著增加。在一项初步研究中,我们还观察到胶原酶处理的兔死后角膜的角膜曲率增加。然而,胶原酶处理的供体角膜的供应是有限的。因此,在下面的研究中,我们研究了使用II型胶原酶诱导兔角膜膨隆模型。
方法:动物和II型胶原酶制备:10只雌性新西兰大白兔,体重3~3.5 kg。自由采食和饮水。在整个研究过程中提供连续的临床护理(每天24小时/每周7天),以确保在需要时及时干预。用5%戊巴比妥钠0.6 mL/kg静脉注射动物,在手术中使用0.4%盐酸奥布卡因滴眼液进行表面麻醉,术前和术后进行眼科检查。II型胶原酶以粉末的形式溶于15%葡聚糖平衡盐溶液,最终浓度为5 mg/mL。
手术:10只兔二十只眼睛,随机分为两组。右眼为实验组,左眼为对照组。用0.6 mL/kg 5%戊巴比妥钠静脉麻醉兔。采用0.4%盐酸奥布卡因滴眼液进行表面麻醉。上皮清创术后,角膜环钻被放置在角膜上。实验组将200μl 的5μg/ml的II型胶原酶溶液转入角膜环,室温下,浸泡30min。然后用棉花拭子洗去溶液,用0.9%氯化钠溶液冲洗角膜。对照眼接受相同的方案,但应用溶液中缺乏胶原酶II型。
眼科检查:在手术前,兔眼接受裂隙灯检查,以证明结膜注射、角膜浸润和角膜基质炎症,在14天的研究中每天重复。
角膜曲率测量法:角膜曲率测量在手术前一天和手术后7天和14天用手持式角膜曲率计进行。在每个时间点进行八次测量,并在屈光度(D)中记录平均角膜曲率(KM)和Km的变化。
角膜厚度测量法:术前7天和术后第14天记录中央角膜厚度(CCT),在表面麻醉下使用手持测厚仪测量。在各时间点进行六次测量,记录平均CCT和CCT的变化。
生物力学测量:在第14天,静脉注射过量戊巴比妥钠使兔安乐死。从每个眼睛获得与相邻巩膜(2毫米宽)的整个角膜。一个4毫米宽的中央角膜条,包括2毫米巩膜两端,用双刀解剖刀沿垂直方向(12:00 - 6:00)切割。角膜带固定在微机控制试验机的夹具上,力为5 N。以3毫米/分钟的速度拉伸角膜条带,记录载荷和变形。弹性模量定义为拉伸应力(每单位截面积的角膜条带的变形量)与拉伸应变之比(由应力引起的长度的百分比变化)。
组织学:剩余的角膜标本用4%聚甲醛固定3天,石蜡包埋。然后将其垂直切成8μm厚的切片,用于苏木精-伊红染色。
结果:眼科检查:术后每日裂隙灯检查均未见结膜注射、角膜浸润及角膜基质炎症。荧光素染色检查显示在手术后约5天角膜上皮完全愈合。
角膜曲率测量法:术前,两组间的Km差异无统计学意义。手术后,实验组KM增加,对照组Km减少。实验组KM在第7天和第14天分别显著增加1.54±1.29 d和0.89±0.89D。与对照组相比,KM在两个时间点(第7天和第14天)均有显著变化。
角膜厚度测量法:两组术前CCT无显著性差异。实验组CCT在第7天和第14天分别下降了23.10±12.17μm和16.10±10.46μm。与对照组比较,CCT的变化在时间点(第7天和第14天)均有显著性差异。
生物力学测量:应力-应变测量显示暴露于胶原酶的角膜硬度降低。胶原酶处理后角膜弹性模量显著降低。5%、10%、15%、20%畸形角膜的弹性模量均低于对照角膜,两组在10%和15%畸形方面差异有统计学意义。
组织学:与对照组相比,实验组胶原纤维排列疏松,观察到层间裂。
结论:研究描述了兔胶原酶诱导角膜膨隆模型,模拟角膜的KC,角膜变薄,以及较低的弹性模量。该模型可用于进一步研究KC的发病机制,并评估这种疾病的新治疗方法。