摘要：近几十年来发生的营养转变正在改变营养状况，减少营养不良，增加肥胖人群的比例。先天免疫反应受饮食影响很大，营养不良和肥胖均发生显著变化。因此，我们研究了蛋白质营养不良和肥胖对小鼠营养和免疫学参数的影响。

 

结果：营养不良动物的腹腔巨噬细胞表现出粘附、铺展和杀菌活性降低的功能；过氧化氢和一氧化氮的产生较低，反映了先天免疫应答的变化。然而，高脂肪动物的巨噬细胞功能略有增加。

 

结论：低蛋白饮食的动物有免疫抑制作用，高脂肪饮食动物增加内脏脂肪组织。炎症过程的存在与腹腔巨噬细胞活性的增加和代谢综合征的类似系统性改变有关。

 

 

背景：肥胖与瘦素和脂肪细胞水平的增加有关，后者是瘦素的主要生产者，以及其他介质，主要是炎性的，如肿瘤坏死因子α（TNFα）、IL-1β和IL-6，它们可能直接或间接地在造血细胞中起作用。瘦素还作用于免疫系统，刺激骨髓中白细胞（WBC）的产生及其迁移。它还可增加促炎细胞因子的产生，如TNFα、IL-6和IL-12、巨噬细胞粘附和吞噬作用，并刺激T细胞的增殖，从而提高免疫能力。最近的研究表明，肥胖导致脂肪组织中的血流减少，导致缺氧，从而引发促炎症过程，增加急性相蛋白如C-反应蛋白和细胞因子如TNFα和IL-6的产生。在肥胖情况下观察到的促炎性细胞因子的产生可能对造血有影响，诱导或抑制骨髓中存在的细胞的增殖和分化。炎症介质也具有激活其他细胞产生不同介质的能力，这可能会影响造血复合机制类型。一些效应发挥增殖作用（如GM-CSF），而其他一些对增殖有明显的造血抑制作用（例如TNFα和IFNγ）。我们组的前期工作表明，营养不良和高脂肪喂养的代谢状况之间的免疫学参数有一些相似之处。发现在低蛋白饮食和高脂饮食中，腹膜、骨髓和血清白细胞减少，以及TNFα的产生和转录因子NF-κB的激活。这项工作的目的是研究这两种饮食在巨噬细胞功能上的相似性和差异性。

 

方法：动物与治疗：瑞士韦伯斯特小鼠，雄性，2-3月龄，对照、低蛋白和高脂肪饮食（表1）在我们的实验室制备并储存在4℃直到使用。根据美国营养学会（AI-93M）的建议，为成年小鼠制备控制饮食。低蛋白饮食含2%的蛋白质。高脂肪饮食以猪油的形式含30%的脂肪，所有其他成分比对照增加了33%，以提供均衡的营养比例。动物在相同的环境条件下单笼饲养，光照/黑暗周期为12/12小时，温度为22±2°C，相对湿度为55±10%。适应期为10～15天（直到体重稳定）。在此期间，动物接受控制饮食和随意饮水，每48小时称重以评估体重。在适应后，将动物随机分为三组：对照组（C）、营养不良组（M）和高脂组（H）。对照组接受控制饮食，而营养不良组开始接受低蛋白饮食，高脂肪组接受高脂饮食。在实验中，每48小时评估体重和饲料。在5周结束时，动物被安乐死以收集生物材料。

 

内脏脂肪和Lee指数的测定：安乐死后，腹膜后和附睾旁脂肪垫被解剖并立即称重。用Lee指数进行体重指数（BMI）。这些值可以表征小鼠在诱导肥胖后的质量变化。

 

腹膜细胞的表型特征：流式细胞术测定腹腔灌洗液的表型特征。将来自腹腔灌洗细胞样品的1×105细胞/ml细胞悬液悬浮于RPMI 1640培养基中，pH为7.4。加入2μL抗体APC-F4/ 80和/或2μL FITC-CD11b抗体，混匀，避光。通过软件FLOW JO 7.6进行分析和补偿。

 

细胞培养：用5ml无菌、无热原的麦考伊5A培养基（pH 7.4）、10%胎牛血清、谷氨酰胺2 mmol/L、100 U/ml青霉素和100 mg/ml链霉素洗涤腹腔细胞。在4℃，1500转下旋转10分钟，将细胞分离下来，在麦考伊5A培养基中再悬浮两次。台盼蓝排斥法测定细胞活力。富含巨噬细胞的培养物1×106/ml个细胞在5%℃加湿空气环境中，37℃下，在24或96孔培养板中孵育2小时。用麦考伊5A培养基三次剧烈冲洗除去非贴壁细胞。巨噬细胞同1 mg/ml  LPS或不含LPS培养基孵育。培养2或24h后，上清液用于测定粘附、铺展、吞噬作用。过氧化氢（H2O2）是培养上清液中的一氧化氮（NO）浓度。. 整个程序是在无菌条件下进行的，所有的材料都是无菌的，没有热原。

 

腹腔细胞黏附能力的评价：腹腔细胞1×105/150μL的浓度，置于含麦考伊氏5A培养基的96孔板中，37度，5%二氧化碳浓度下孵育1h。此后，用培养基进行洗涤以除去非粘附细胞。在37℃，5%二氧化碳的条件下，在湿润气氛下，在1.25μL/ml LPS存在下培养细胞2-24h。采用结晶紫法测定贴壁细胞数。PBS冲洗后，室温下，用4%多聚甲醛30ul固定10min。固定后，在甲醇溶液中加入50μl的结晶紫（0.25克结晶紫；PA 10毫升甲醇；40毫升去离子水）加入到每孔中。在室温下，黑暗中保持30分钟。用PBS pH 7.4洗涤每孔后，加入50μL 0.1M柠檬酸钠。上清液被转移到另一个板上，其吸光度在波长为550 nm的情况下测定。

 

 

腹腔细胞铺展试验：使用24孔培养板，在每孔底放置13～18毫米无菌盖玻片。用24孔板培养皿（37°C，5% CO2）培养1×106巨噬细胞。用麦考伊的5A无菌培养基，pH 7.4，用三次强力洗涤除去非贴壁细胞。然后在1 mL的麦考伊5A无菌培养基中培养粘附细胞，pH为7.4，在存在或不存在1.25 Lg/ml LPS的情况下培养。5% CO2， 37℃下培养2, 24, 48、72 h。在此期间，收集上清液，用PBS，pH 7.4洗涤盖玻片，用2.5%戊二醛固定20分钟，用吉姆萨溶液染色。

 

腹腔巨噬细胞的吞噬和杀菌活性：白色念珠菌ATCC Y-837的悬浮液。仅使用具有超过95%活性的酵母悬浮液。将悬浮液调整至2×107酵母细胞/ml。2×106 500微升/毫升的腹腔细胞悬浮液，添加500μL的白色念珠菌溶液，维持1-10个酵母细胞。37℃下培养，在10 rpm混匀，在30, 60, 90和120分钟后取出等分试样，并进行细胞离心试验。盖玻片立即固定，并用吉姆萨溶液染色。对照组包括500ul的PBS和500ul的腹腔细胞悬液。对于吞噬作用的评估，计数至少200个腹膜细胞，并将呈现一个或多个内化白念珠菌细胞的那些细胞视为吞噬活性，其值以百分率表示。根据Herscowitz所描述的对杀菌活性进行了评价。活酵母细胞被吉姆萨染色蓝色，而死亡酵母细胞根本没有着色。吞噬细胞的数量是可变的，因此杀菌活性通过评分来表达。当白色念珠菌死亡时，死亡1倍（评分1），白色念珠菌死亡2倍（2分），白色念珠菌死亡三倍，三倍（3分），白色念珠菌四倍以上死亡（4分）。根据分类，计数至少200只吞噬白念珠菌的巨噬细胞的评分。所有样品均重复处理。

 

培养上清液中NO和H2O2的测定：用格里斯比色法测定一氧化氮（NO）的产生。过氧化氢（H2O2）的测定采用过氧化物酶依赖的苯酚红氧化法。

 

结果：食物摄入与体重增加：对照组与营养不良组的进食量相似；高脂组的消耗量为33%。在实验开始时，所有组都有相似的体重，通过改变脂质和蛋白质的量，导致高脂肪组增加他们的体重和营养不良的动物显著下降。酶的体重。与对照组和营养不良组相比，高脂饮食动物具有更高的Lee指数。HL组脂肪垫的总重量与其他组相比有显著性差异，尤其是附睾脂肪。营养不良和对照组差异无显著性。

 

腹腔细胞的表型特征：采用流式细胞术（CD11b）（FITC）和F4/ 80（APC）对腹膜腔群体进行表型评价。双标记的细胞被归类为巨噬细胞。在营养不良的动物中，巨噬细胞的比例降低，对照组和高脂肪动物之间的比例相似。

 

腹腔巨噬细胞的粘附与铺展：腹腔巨噬细胞培养2小时，在此期间，营养不良组的巨噬细胞粘附减少，而高脂肪动物的细胞粘附力增加。另外，用LPS刺激三组细胞。然而，培养24小时的细胞降低了对LPS刺激的反应。营养不良的动物继续减少粘附，而对照组和高脂肪具有相似的粘附能力。

 

腹腔巨噬细胞的吞噬和杀菌活性：高脂组120 min后吞噬细胞对白念珠菌吞噬功能增加，但营养不良组90分钟后吞噬细胞活性下降。比较对照组、营养不良组和高脂组，我们注意到，在30, 60和90分钟，营养不良组的吞噬功能降低，而对照组和高脂组没有显著差异。

 

腹腔巨噬细胞产生过氧化氢和一氧化氮的评价：营养不良组对PMA的刺激没有反应。在未刺激的条件下，来自所有组的细胞没有显示统计学差异，但是当它们与对照组和高脂组的PMA细胞刺激时，与未刺激的相比，过氧化氢的产生增加。

 

结论：蛋白质营养不良通过减少巨噬细胞的数量和功能而损害先天免疫反应，巨噬细胞对物质的激活和产生反应不佳。在高脂饮食的小鼠模型中，我们观察到内脏脂肪组织的增加和炎症过程的存在，巨噬细胞在该组织中的活性增加和全身变化类似于代谢综合征。