摘要：肥胖个体的代谢和心血管并发症的风险不同，这取决于脂肪分布（皮下和内脏）和脂肪组织（AT）表型（增生性与肥厚）。然而，确定肥胖个体是否代谢健康或不健康的确切机制尚不清楚，并且缺乏合适的体内模型限制了潜在病理机制的分析，代谢健康与代谢不健康的AT积累可以特异诱导。我们的目的是建立一个使用斑马鱼作为肥胖相关代谢健康模型和代谢不健康的模型。

 

方法：我们用正常脂肪饮食（NFD）或高脂肪饮食（HFD）对成年雄性斑马鱼进行过喂饲8周，并比较与肥胖有关的参数，即体重、体重指数、状态指数和体脂百分比，以控制在生理条件下喂养的斑马鱼。此外，我们通过量化血糖水平、血浆甘油三酯和胆固醇水平，并通过评估斑马鱼肝脏中异位脂质积累，研究了早期肥胖相关的代谢改变的存在。最后，我们确定了内脏AT和肝脏中脂质代谢、炎症和纤维化相关的标记基因的基因表达水平。

 

结果：与对照组相比，NFD或HFD 8周过量喂养导致体重和脂肪的显著增加。与NFD过度喂养相比，HFD过度喂养斑马鱼肝脏高血糖与异位脂质积聚，脂肪细胞肥大，特别是在内脏，代谢不健康，伴随着脂质代谢，炎症和纤维化标志基因的表达变化。

 

结论：综上所述，我们建立了斑马鱼代谢性肥胖表型特异诱导的方法。结果表明，在研究代谢健康与代谢不健康肥胖的发展过程中确定AT表型的调节机制方面斑马鱼是一个有吸引力的模型。

 

 

背景：肥胖的特征是在正能量平衡的存在下脂肪组织（AT）的积累增加，是代谢和心血管疾病以及过早死亡的危险因素。根据身体脂肪分布和表型，肥胖个体对肥胖相关疾病的易感性不同，如脂肪变性和2型糖尿病。与代谢性健康肥胖（MHO）表型相比，代谢性不健康肥胖（MUO）表型表现出有害的分布和内脏脂肪较多，脂肪细胞大小较大，炎症过程的表型。在肥胖发育过程中测定体内脂肪分布和/或表型的机制受到缺乏合适的体内模型的限制。在该模型中，代谢健康与代谢不健康的积累可以特异性诱导。最近，斑马鱼已经成为一种替代的脊椎动物模型，用于研究脂质代谢和代谢性疾病，如肥胖、2型糖尿病和肝骨病。斑马鱼的器官和组织在结构和功能上与人类相似，神经内分泌水平的能量平衡调节是保守的。此外，饮食诱导的斑马鱼肥胖与哺乳动物的肥胖有共同的病理生理途径。我们的目的是建立斑马鱼作为一个模型参与发展MUO或MHO的分析机制。我们用正常脂肪或高脂饮食过量喂养成年斑马鱼来评价短期饮食诱导肥胖的不同模式，分别评估AT累积、AT表型和相关代谢改变的发生。

 

方法：斑马鱼喂养：斑马鱼饲喂温度28度，14/10h光暗循环。使用AB株雄性斑马鱼。AB株最常用于研究斑马鱼的肥胖和肥胖相关的过程。雄性AB斑马鱼被分配给三个饮食组：对照组饲喂卤虫（22%脂肪，44%蛋白，16%碳水化合物），保持重量（每鱼每天5mg卤虫）；另一组在正常的脂肪饮食条件下过度喂卤以诱发肥胖状态（NFD-OF，60mg卤虫）。第三组饲喂卤虫（5毫克卤虫）和蛋黄粉（59%脂肪，32%蛋白质，2%碳水化合物；30毫克）的组合，模仿高脂肪饮食（HFD-OF）。每3 L水饲喂10条斑马鱼，一天喂养一次。在第8周，斑马鱼禁食过夜并处死。每天5mg卤虫相当于成年斑马鱼的生理能量需要。三个独立喂养实验在18个月的时间内进行。在每个独立实验中，斑马鱼的年龄分别是受精后92天（DPF）、99 DPF和179 DPF，这对应于受精后3-6个月（MPF）。试验开始前和结束时（第8周）记录了麻醉斑马鱼的体重和长度，计算体重指数（BMI）和富尔顿状态指数。由于我们每箱10条鱼，在喂食过程中追踪分析个体鱼是不可能的，体重、长度和相关参数均为每罐平均值。为了排除发育和生长变化对我们的结果的影响，喂养组根据身体长度和体重进行匹配。在没有麻醉的实验中每两周测定体重以排除频繁麻醉的结果的偏倚。第8周，用ECHOMRI 4IN1分析体脂百分率。用血糖仪测量背动脉的空腹血糖。对于血浆甘油三酯和胆固醇水平的分析，从背动脉收集血液样本，一个喂养组汇集一组。将血液样品离心，收集上清液中。使用LabVISA检测甘油三酯试剂盒和ApMeX?红胆固醇测定试剂盒测定甘油三酯和胆固醇水平。

 

磁共振成像（MRI）：MRI实验是在BRUKER超前DRX 300 MHz核磁共振光谱仪上进行的，它配备了2.5个微成像单元。在MRI测量之前，将斑马鱼安乐死，固定在含10%W/W氯化钠的2%W/V的低熔点琼脂糖溶液中。为了确定鱼的位置，使用TraciLoT Flash序列进行概览扫描。选择16×16×250毫米的视场，包括整条鱼。FOV被分成50个厚度为0.5毫米的轴向切片。平面分辨率设置为128×128。比较8例成年雄性AB斑马鱼受精后6个月的磁共振成像和体感MRI的体脂定量。为此，基于噪声分布对MR图像进行背景校正，并通过相应的接收机增益对强度进行缩放。

 

组织学：全斑马鱼用4%聚甲醛固定，石蜡包埋，横切面。皮下和内脏区域解剖上可比较的切片用苏木精-伊红染色，并在40X放大镜下获得显微图像。图像分析使用Image J软件。对每个鱼的皮下和内脏脂肪细胞进行计数，每个脂肪细胞的细胞面积被手动测量。为从斑马鱼肝脏制备冰冻切片，新鲜分离的肝组织被植入组织TEK，冷冻至80°C，并用低温恒温器切割。切片干燥，4%多聚甲醛固定，用油红O染色，并通过显微镜分析。

 

RNA分离及mRNA表达分析：用TrimoL试剂对内脏和肝脏进行匀浆，用RNeasy Mini Kit从水相中分离总RNA。用M- MLV逆转录酶和随机六聚体引物将500 ng RNA逆转录为cDNA。

 

蛋白质分离与免疫印迹分析：从TrIZOL组织裂解物的有机相中分离出蛋白质，这是RNA分离过程的副产物。根据制造商的指示沉淀蛋白质。

 

结果：我们用正常脂肪饮食（NFD-OF）或高脂饮食（HFD-OF）过量喂养成年雄性斑马鱼，与对照饮食相比，在8周内评估斑马鱼的饮食诱导肥胖。与对照鱼相比， NFD-OF和HFDD饲喂的鱼都有较大的腹部。在8周的饲养试验中，对照组动物体重维持稳定。在NFD组中，鱼的重量几乎增加了一倍，但HFD组鱼体重的增加并不显著。NFD和HFD组鱼均显示体重指数和富尔顿状态指数显著增加。鱼体脂肪含量在NFD和HFD中均有增加，但各组间差异不显著。与对照组相比，HFD但非NFD的血糖水平显著高于对照组，且血浆甘油三酯和胆固醇水平显著升高，肝脏和肌肉中的脂质异位累积显著增加。与NFD或对照相比较，在肝裂解物中磷酸化Akt和总Akt蛋白水平的免疫印迹分析显示表明胰岛素抵抗的早期状态。斑马鱼横截面MRI和HE染色分析脂肪分布：与对照组相比，NFD组和HFDD组皮下和内脏均增加。NFD组和HFD组均表现出内脏脂肪细胞数量增加的趋势。NFD组鱼皮下脂肪细胞数显著增加，而HFD组鱼脂肪细胞数略有增加。与对照组相比，NFD和HFDD的内脏和皮下脂肪细胞显著增加。HFD-斑马鱼与NFD组斑马鱼相比，内脏较大但皮下脂肪细胞较小，表明在表型上存在代谢不健康。

 

为了更详细地评估NFD和HFD组鱼类AT和肝脏中的分子差异，我们确定了脂质储存和炎症的标记基因的表达，这些基因与啮齿类动物和人类不同的肥胖表型相关。在NFD或HFD过量喂养后内脏AT，没有发现脂肪细胞分化标志物PPARG的显著改变。与NFD组鱼相比，HFD组鱼PPARG显著降低。此外，还分析了脂肪储存标志物FABP11A的表达。这是斑马鱼的人类FABP4直系同源物，fasn和srebf1是FASN表达的上游调控因子.。FABP11A表达仅随摄食量的增加而略有增加，但FFN和SREBF1在NFD组上调，而在HFD组没有改变。LPL是脂蛋白脂酶和脂质代谢的中枢调节因子，相比于对照组， NFD组表达显著升高，而HFD组保持不变。相反，脂酶ATGL和HSL的表达不受NFD和HFD过度摄食的影响。炎性标志物IL1B和TNFA显示IH1B在鱼类HFD-D中的表达上调，表明炎症轻微增加，TNFA保持不变。肝脏表达谱分析显示，HFD组斑马鱼的FABP11A表达显著增加，而NFD组则不明显。此外，与对照斑马鱼相比肝脏FasN表达在NFD组中上调，但在HFD组中显著下调。与对照组相比，SRBEF1在NFD组增加，HFD组降低。脂肪酶ATGL、HSL和LPL和炎性标志物IL1b在鱼类NFD或HFD组中的表达没有改变。在过量饲养条件下，肝脏中TNFA的表达增加。HFD过度喂养斑马鱼肝脏存在纤维化。

 

结论：已经在斑马鱼中建立了MHO与MUO的诱导方案，提供一个有吸引力的模型来研究不同类型肥胖与表型和代谢状态相关的调控机制。