摘要：微生物对行为和应激反应的影响知之甚少。斑马鱼幼虫有利于神经免疫研究的独特特征，然而，它们目前未被充分利用。我们使用无菌的斑马鱼来确定微生物对行为和压力测试的影响。微生物的缺失极大地改变了运动和焦虑相关的行为。在缺乏微生物暴露的幼虫中，对急性应激源的特征性反应也被消除。益生菌乳杆菌处理能有效地减轻常规饲养的斑马鱼幼虫的焦虑相关行为。这些结果强调了微生物通过微体肠-肠轴向中枢神经系统传递的重要性，并为斑马鱼幼虫的神经免疫研究奠定了基础。

 

 

简介：斑马鱼幼虫是一种新兴的神经行为研究高通量模型系统。受精后2天和3天从绒毛膜孵化后，幼虫在受精后4～5天表现出大量的神经行为表型。这些幼虫的许多行为与人类神经过程和疾病中所见的相关，如焦虑、学习、恐惧、社交和精神病。斑马鱼幼虫最具特征性的行为之一是焦虑相关行为，通常由趋化性或接近垂直表面的倾向来测量。这种行为在进化上是保守的，并表现在一系列物种中，包括啮齿动物、鱼类和人类。趋化行为是斑马鱼幼虫焦虑的一个很好的指标，由于抗焦虑药和焦虑药物分别显著减弱和增强了这种行为。斑马鱼幼虫也表现出类似于哺乳动物的应激反应，其中应激反应很大程度上依赖于下丘脑-垂体-肾上腺皮质（HPA）轴及其糖皮质激素的合成。报告显示斑马鱼下丘脑-垂体-肾间质（HPI）轴与哺乳动物HPA轴的功能和解剖相似性。皮质醇是斑马鱼和人类的主要皮质类固醇，与皮质酮是主要皮质类固醇的啮齿动物不同。在应激反应中，HPI轴被激活，血浆皮质醇的升高是通过ACTH结合激活黑素皮质素2型受体（MC2R）介导的。甾体生成的急性调节蛋白（STAR）和11β-羟化酶参与了皮质醇合成的最后步骤，对急性应激源的反应也有所增加。脊椎动物的早期生活中发挥作用的皮质激素系统和应激反应的因素尚不清楚。最近，已经有许多研究表明微生物和神经发育和应激相关行为之间的双向影响。例如，社会压力可以改变肠道微生物群的结构，而微生物群的改变会影响神经系统疾病和行为的模式。Clarke 等人还表明早期生命微生物在影响中枢神经系统信号转导中起着关键作用。此外，哺乳动物和斑马鱼在摄入特定益生菌乳酸杆菌后，焦虑相关行为和应激症状均有所下降。例如，胚牙乳杆菌已经被证明可以减少焦虑相关行为并降低应激相关的炎症细胞因子水平。有趣的是，在斑马鱼的殖民化过程中，这种特殊的菌株被证明是高度粘附于肠上皮的。微生物通过多种潜在途径向中枢神经系统（CNS）传递信号。可能的通讯机制包括通过肠屏障进入循环系统的各种代谢产物的产生，和/或微生物产生的代谢物，这些微生物可以通过免疫系统发出信号。此外，迷走神经从肠神经系统（EN）传入中枢神经系统的通路已被认为是微生物和中枢神经系统之间的主要沟通途径。被认为在维持肠上皮屏障和调节粘膜免疫反应中起着关键的作用。 Kabouridis等人表明小鼠肠道内的神经胶质细胞对出生后的神经胶质细胞的排列和持续的供应进行调节，进一步表明，这是微生物-肠-脑轴的关键途径。神经嵴细胞通过多种信号产生双侧迷走神经通路，包括激素线索、神经营养素和与其他细胞的直接相互作用。胃肠道迷走神经外神经支配的发育在喂养开始之前就发生了，这与其他脊椎动物种类相当。斑马鱼幼虫具有独特的特性，有助于阐明微生物在肠道-脑轴中的作用机制。斑马鱼的光学透明性允许体内标记与宿主细胞相互作用的细菌。斑马鱼的子宫外发育允许在整个发育过程中容易地操纵微生物接触和微生物参与，与哺乳动物的神经行为相似性和容易产生和控制生斑马鱼幼虫的能力使它们成为神经免疫研究的有价值的模型。在这里，为了研究微生物在斑马鱼幼虫中影响焦虑相关行为和应激反应的能力，在无菌或常规环境中饲养的幼虫中评估了趋化性（衡量斑马鱼幼虫的焦虑相关行为）。应激反应通过皮质醇产生反应来评估渗透胁迫的挑战。

 

动物：本研究采用野生型斑马鱼。受精后立即采集受精卵。，均匀地分成不同的组进行后续实验。由于斑马鱼幼虫数量高，可以一次采集足够数量的胚胎，用于一天的所有组别的实验。这是理想的消除离合器之间的变化，并消除在非无菌幼虫组使用的鱼水的微生物含量的变化。在含有250 mg/ml两性霉素B、5μg/mL卡那霉素和100μg/ml氨苄西林（AB FISH水）的无菌鱼水中收集胚胎。在分类去除未受精的胚胎后，将活胚胎转移到组织培养罩，在AB鱼水中轻轻洗涤3次。在0.1% PVP碘溶液中浸泡2分钟，然后用无菌鱼水立即清洗3次。在洗涤后，将胚胎浸入0.003%漂白溶液中1小时，然后用无菌鱼水洗涤3次。最后，将胚胎移植到无菌组织培养瓶中，并保持在28.5°C培养箱中。常规化（CV）胚胎遵循与GF胚胎相同的灭菌过程，除了被放置在常规的鱼水中，而不是无菌的鱼水。常规饲养的（CR）胚胎在常规的鱼水中收集和保存，而不进行灭菌过程。斑马鱼幼虫在其环境中以密度为1的幼虫/ml饲养，直到受精后6天（DPF），乳酸杆菌给药是按照先前公布的协议进行的。简单地说，益生菌在37°C培养基中培养24小时，在400 0g离心5分钟，然后用无菌鱼水洗涤。在4 DPF时，斑马鱼幼虫暴露于2×107 CFU/ml植物乳杆菌。斑马鱼幼虫被允许暴露于植物乳杆菌2天（直到6 DPF检测）。

 

微生物DNA的提取与定量：根据先前公布的方法提取微生物DNA。安乐死后立即将12只斑马鱼幼虫无菌地收集到800μL的裂解缓冲液（500 mM NaCl、50 mM TrI HCl、50 mm EDTA和4%个SDS）中，在QiaGeAN组织匀浆液中均质3分钟，在70℃下孵育20分钟。在室温下离心5分钟后，将上清液与200μl的10 mM乙酸铵混合，在冰上孵育5分钟，然后在室温下以16000克离心10分钟。将750μl的上清液与等体积的冷冻异丙醇混合，在冰上孵育30分钟。在4°C下，将试管内的内容物16000g离心15分钟，提取DNA。将沉淀物用70%乙醇溶液漂洗两次，再悬浮于150μl的TrIS-EDTA中。加入15μL蛋白酶K和200μL缓冲液，在70℃下培养10分钟。按照说明进行后续步骤，并定量DNA。

 

运动活性与趋化性分析：简单地说，斑马鱼幼虫被单独放置在无菌的24孔板中，烧瓶中含有1毫升/孔的培养基。然后将该板定位在透射的LED光台顶上以最大化对比度并便于跟踪。幼虫在摄录开始前10分钟到记录场。在驯化期后，在自由游泳10分钟内记录总行程、平均速度和活动时间。为了检验焦虑相关行为，也在行为试验期间计算了趋化性。很好地定义了抗焦虑和焦虑剂显著改变斑马鱼幼虫在测定过程中的时间。趋化行为被定义为幼虫靠在其孔侧的4毫米以内；因此，在中心区花费更多时间或有更多进入中心区的幼虫被称为较少趋化性。每次都使用新的24孔板。

 

渗透胁迫：根据先前公布的协议进行渗透压应力测试。简单地，将斑马鱼幼虫在28.5℃的含100 mM NaCl的鱼水中孵育10分钟。然后将幼虫固定在冰冷的鱼水中。用于RNA提取的14个幼虫收集在500μl的管中。用于皮质醇提取的幼虫放入干管（每管正好14个幼虫），并在乙醇/干冰浴中冷冻。所有样品均保存在-80°C直到使用。

 

结果：无菌斑马鱼幼虫的特性研究：受精后立即采集胚胎，随机分为三组。将一组直接放入常规鱼水中（常规饲养；CR组），另两组进行灭菌处理。灭菌后，将胚胎收集到含有无菌鱼水（无菌的；GF组）或含有常规水的组织培养瓶的组织培养瓶中。为了确认各组的微生物状态，进行了五个独立的试验，以确保斑马鱼幼虫群的无菌和/或表征微生物群。每天用10μl的培养瓶水接种血液琼脂平板，有氧条件下在28.5℃培养。在实验结束时（6 DPF），还对28.5℃的厌氧条件下培养液中的幼虫烧瓶中的无菌性进行了测试。在任何GF或只培养瓶中均未发现细菌生长。微生物DNA模板也被用于16 S rRNA扩增子测序，以确定哪些微生物类群存在于CV和CR组中。主成分分析表明，这些群体具有不同但一致的微生物种群。微生物群的这种分化可能是由于微生物在绒毛膜上定居。根据生产商对匀浆斑马鱼幼虫的指示进行活菌染色，以检测活的微生物细胞。与培养方法一致，在CV和Cr幼虫中鉴定出活菌，但在GF幼虫中未检测到活菌。

 

微生物调节运动和焦虑相关行为：为了确定微生物是否影响斑马鱼幼虫的焦虑相关行为，进行了运动活性测试，并评估了在常规或无菌条件下饲养的幼虫的趋化行为。与CV和CR FISH相比，GF-斑马鱼显示出超运动活性，虽然平均运动速度没有显著差异。这是通过进入中心区的数量和在运动活动测试期间花费在中心区的时间来评估的。CR和CV之间没有发现差异，尽管它们具有不同的微生物分布。这些结果表明，微生物在斑马鱼幼虫的运动活动和焦虑相关行为中起着重要的作用。

 

HPA（HPI）轴应力受微生物区系的影响：为了研究微生物群对斑马鱼幼虫应激反应的生理反应，进行了渗透胁迫试验，测定了与HPI轴有关的因素。CV和CR幼虫表现出预期的应激反应，皮质醇水平显著高于未治疗的对照组。有趣的是，GF幼虫在皮质醇生成中没有表现出应激反应的升高。作为验证渗透胁迫生理反应的次要手段，实时PCR用于评价斑马鱼和哺乳动物中三个与应激反应相关的基因的表达，包括黑素皮质素2型受体（MC2R）、11β-羟化酶和类固醇生成的急性调节蛋白（STAR）。与皮质醇产生一致，在非无菌环境中（即CV和CR）的幼虫在应激反应中增加了MC2R、11β-羟化酶和星形基因表达，而GF-FISH相对于对照没有显著变化。为了确定在微生物能够改变应激反应的早期生命中是否存在临界时间窗，斑马鱼幼虫在0 DPF、2 DPF（孵化前）和5 DPF中被常规化，并在6 dPF下进行应力测试。虽然在5 DPF常规培养的幼体中皮质醇产量有轻微的下降趋势，但在随后的时间点和Cr幼虫之间常规培养的幼虫没有观察到显著差异。这些结果强调了暴露微生物对应激反应的重要性。

 

结论：这项研究的结果加强了先前的研究结果，表明微生物在应对应激和应激相关行为中起着重要作用。需要进一步的研究阐明微生物通过与CNS通信来调节行为和应激反应的确切机制。然而，本研究结果为斑马鱼幼虫的利用奠定了基础。