摘要：与哺乳动物相反，，斑马鱼有能力在各种损伤后再生视网膜神经元。斑马鱼视网膜中存在两种类型的胶质细胞，Müller细胞（MG）和小胶质细胞。最近的研究表明，MG引起再生的视网膜神经元，但驻留小胶质细胞和先天免疫系统的作用更为普遍，在视网膜再生期间没有明确界定。具体地说，在神经元大量死亡和成功的再生反应之后，免疫系统和小胶质细胞的特征尚未被记载。

 

方法：神经毒素乌本苷用于诱导斑马鱼视网膜内实质性视网膜病变。这种损伤导致再生反应，主要恢复视网膜结构、神经元形态和结缔性，以及视觉功能。我们分析了免疫荧光和H＆E染色后受损眼睛的冰冻切片，以表征病变的初始免疫应答。用共聚焦显微镜分析小胶质细胞的形态和分布。

 

结果：我们发现有证据表明乌本苷注射后早期白细胞浸润视网膜，随后免疫细胞增殖。这可能包括驻留的小胶质细胞和大量增殖的、视网膜外衍生的巨噬细胞，导致视网膜损伤迅速累积。免疫细胞增殖后，Müller细胞重新进入细胞周期。损失的视网膜进行组织再生，小胶质细胞保持激活的形态学特征，表明正在进行的功能对于视网膜功能的恢复可能是必不可少的。

 

结论：总的来说，这些结果表明小胶质细胞和免疫系统在视网膜成功再生反应期间是动态的。本研究为探讨视视网膜再生过程中小胶质细胞的启动和功能提供了重要框架。

 

 

背景：由于急性创伤或退行性疾病，哺乳动物视网膜不能再生受损的神经元。而不能恢复丢失的神经元，神经胶质反应随之而来，这通常与持续炎症有关。炎症是机体对组织损伤和/或感染的反应，是由先天免疫系统引发的。炎症包括免疫细胞的激活和促炎细胞因子和分子介质的产生。激活的特定细胞类型和产生的细胞因子/分子介质将有所不同，取决于初始的损伤、组织位置和解决感染或损伤所需的免疫应答。在哺乳动物视网膜内，驻留的小胶质细胞能迅速感知微环境的变化，并能启动并参与急性和慢性炎症反应。急性炎症对于清除死细胞、碎片和病原体至关重要，这些必须在随后开始组织修复之前发生。然而，当炎症变成慢性时，它可以是极其有害的，并有助于组织病理。虽然在哺乳动物神经退行性疾病中的慢性炎症和免疫激活是广为人知的，但是免疫系统在成功视网膜再生中的作用尚未被很好地探讨。与哺乳动物相比，硬骨鱼在各种破坏神经元的损伤后具有再生受损视网膜的显著能力。斑马鱼视网膜再生神经元的来源是Müller胶质细胞，视网膜胶质细胞也存在于哺乳动物和其他脊椎动物中。损伤后，Müller胶质细胞重新进入细胞周期并经历不对称分裂，最终产生多能祖细胞，取代丢失的视网膜神经元。哺乳动物和其他脊椎动物的Müller胶质细胞似乎具有显示再生潜能的特性，包括祖细胞标志物上调和细胞周期重新进入，但这反而导致胶质增生，因为无法分化成神经元。一般来说，退化期之后是再生期，其中丢失的细胞类型被替换，组织结构被恢复。组织驻留巨噬细胞对于协调受损组织的清除以及指导新细胞类型的分化以替代受损组织至关重要。在再生反应开始之前，驻留的巨噬细胞以及新募的吞噬细胞，例如中性粒细胞、单核细胞衍生的巨噬细胞和从其他组织迁移的巨噬细胞参与吞噬和清除退化碎片。在斑马鱼中，招募的巨噬细胞对周围神经系统组织的再生至关重要。在具有这种再生能力的生物体，如硬骨鱼，中枢神经系统的再生中，先天免疫系统和常驻巨噬细胞，即小胶质细胞的作用尚未明确界定。炎症在成年斑马鱼脑的再生中也被认为是重要的。然而，目前还不清楚这些发现是否转化成成年动物的视网膜再生。在正常情况下，视网膜小胶质细胞高度分支并整合在高度组织化的视网膜组织中。小胶质细胞对视网膜损伤和变性的反应主要是在啮齿动物模型系统中进行的。一般来说，当对神经损伤作出反应时，小胶质细胞迁移到细胞死亡部位。斑马鱼对视网膜损伤的小胶质细胞反应尚未得到很好的记载，并且目前尚不清楚在何种条件下视网膜损伤视网膜外免疫细胞可能参与对神经元变性的初始反应。迄今为止，斑马鱼的研究集中在炎症、特异性细胞因子和小胶质细胞/巨噬细胞如何影响Müller胶质细胞的增殖，从而产生再生的视网膜神经元。对于小胶质细胞在中枢神经系统的发育和维持中的作用以及它们参与神经退行性疾病，以及可能是神经退行性疾病的来源，已经引起了广泛的关注。关于小胶质细胞在启动和/或形成视网膜神经元成功再生中的作用还知之甚少。在本研究中，我们使用组织破坏性病变，眼内注射神经毒素乌本苷，破坏视网膜内神经元，同时保留胶质和光感受器。已知这种类型的损伤导致再生反应，该反应在很大程度上恢复视网膜结构、神经元形态和结缔性以及视网膜功能的行为。我们对这种细胞毒性损伤的初始反应进行表征，以确定先天免疫系统如何对视网膜变性作出反应，随后是成功的再生反应。然后我们研究再生视网膜中的小胶质细胞的特征，包括分布、形态、选择性标记物和组织学特征。在受损斑马鱼视网膜中，驻留和浸润的免疫细胞有助于对神经元细胞死亡产生强有力的反应，随后立即发生Müller胶质细胞增殖。在视网膜层的组织学再生时，驻留的小胶质细胞定位于再生神经元的区域，并维持指示正在进行的功能激活的形态。我们的研究结果表明，成年斑马鱼视网膜再生提供了一个极好的系统，以发现免疫系统和小胶质细胞的功能作用，这可能是支持再生反应成功的关键。

 

动物：本研究中使用的斑马鱼转基因系包括mpeg1:GFP(gl22 Tg，GFP在小胶质细胞/巨噬细胞中表达，可从斑马鱼国际资源中心获得)；mpeg1:mCherry(gl23 Tg，mCherry在小胶质细胞/巨噬细胞中表达，可从ZIRC获得)。gl22 Tg和gl23 Tg转基因株系标记视网膜组织细胞.

 

视网膜病变：为破坏斑马鱼视网膜内神经元和备用光感受器和Müller胶质细胞，玻璃体腔注射乌本苷，对6～14个月的斑马鱼视网膜进行化学损伤。在0.65%无菌盐水（NaCl）溶液中制备了40μM乌本苷。将鱼浸泡在三卡因溶液中麻醉，用刀片在角膜上进行切口。将Hamilton注射器置入晶状体后，将0.4-0.6μl的40μM乌本苷溶液注入玻璃体中。注射的体积基于眼睛的直径(用卡尺测量)以及基于眼睛和晶状体的几何形状和体积的计算，结果估计眼内浓度为2μM。单侧病灶，仅注射右眼。对照组用0.65%无菌盐水（NaCl）溶液注射右眼。对于所有的实验，3条对照（盐水注射）组鱼和3 - 4乌本苷注射的鱼被用于随后的分析。

 

组织采集与处理：在选定的时间点注射后，收集组织样本进行分析。对于整个视网膜采集，鱼暗适应大约12小时，在曲卡因溶液中麻醉，然后用细镊子摘除眼，并置于磷酸盐缓冲(pH=7.4)盐水(PBS)中进行解剖。摘除角膜和晶状体，剥离视网膜。由于暗适应，视网膜色素上皮（RPE）从视网膜上脱离，并且使用软画笔刷去任何剩余的RPE。然后用塑料转移移液管将视网膜在新鲜PBS中冲洗几次，在室温下用恒定的温和搅拌将视网膜转移到由4%多聚甲醛组成的PBS中固定剂中约1小时，然后用含有0.01%TritonX-100的PBS洗涤几次。为了制备视网膜冰冻切片，用精细镊子摘取眼球，转移到PBS，取出晶状体。然后将眼睛固定在磷酸盐缓冲的、含5%蔗糖的4%多聚甲醛中，在室温下持续1小时，在磷酸盐缓冲的(pH=7.4)5%蔗糖中洗涤，然后以分级洗涤，最后用20%蔗糖洗涤。将组织包埋在1:2的OCT包埋介质和磷酸盐缓冲溶液，20%蔗糖。冷冻后，切片，干燥一夜后，将玻片上的组织切片保存在-20°C直到使用。为了评价gl22 Tg和gl23 Tg的共同标记，在受精后3天固定整个胚胎，并用上述PBST洗涤整个视网膜。

 

免疫荧光：用20%山羊血清在室温下封闭固定组织1h，4℃下与一抗孵育1～3d，PBST洗涤3次，4℃下与二抗和DAPI孵育1～3d，PBST洗涤2次。最后PBS清洗一次。所有抗体孵育和洗涤均以恒定搅拌方式进行。然后通过切割视网膜周边的四个狭缝将整个视网膜平贴，盖上盖玻片，用透明指甲油密封。

 

HE染色：冷冻切片室温干燥30min，浸入0.1%苏木精5分钟，然后在自来水中冲洗5分钟。然后将玻片在0.5%伊红中浸泡1分钟，在去离子水中漂洗直到漂洗干净，然后浸入一系列乙醇溶液(50、75、95和100%)中各30s-1分钟，在二甲苯中浸泡5次，后封片。

 

视网膜冰冻切片中免疫细胞的定量（注射后24～72小时）：在对应于视网膜内病变区域的冰冻切片获得每个图像感兴趣区域：从外核层的基底边界到神经节细胞层的基底缘。损伤后48小时和72小时（HPI），根据致密DAPI染色的极限定义该边界的基底层。. 用L-plastin+细胞体包围的DAPI+细胞核在限定的感兴趣区域内进行计数，并标准化每1000平方微米。所分析的区域对应于受损的内视网膜，其中x方向平行于视网膜层，y方向垂直于视网膜层。由于乌本苷引起的损伤导致内核层受损并变薄，因此每100μm的视网膜弯曲线距离使用一条平行于ONL的基底边界的线来报告L-plastin+细胞的数量。每条鱼分析三至四个非相邻冰冻切片。

 

全扁平视网膜（组织学再生视网膜）免疫细胞的定量：在包含所有z平面的单个图像堆中，从神经节细胞层的玻璃体表面到外核层的顶面，对扁平化全视网膜中的单个小胶质细胞进行计数。对每1000平方微米扁平化的视网膜的小胶质细胞进行计数，其中X和Y方向平行于视网膜层。计数归一化为面积而不是体积。因为再生的视网膜比对照组薄。每个视网膜分析6-8个视图。

 

结果：组织破坏性视网膜病变的免疫细胞反应：为了研究视网膜实质神经元损伤的免疫反应，我们使用玻璃体内注射神经毒素乌本苷来产生这种损伤。注射乌本苷至最终药物浓度2μM可导致视网膜内神经元死亡，如PKCα+双极神经元在注射后3天（DPI）丢失。注射后24小时和48小时（HPI）内视网膜TUNEL＋核出现。光感受器和神经胶质得以幸免，如ZPR1+锥体和Zrf1+Müller神经胶质细胞在3 DPI持续存在。我们用斑马鱼L-plastin抗体观察对照和乌本苷损伤视网膜中的小胶质细胞/免疫细胞，该抗体用于标记斑马鱼中的白细胞，包括巨噬细胞。与胚胎斑马鱼和幼鱼中的报道类似，完整、未受损的成年斑马鱼视网膜中的小胶质细胞位于内核层、神经节细胞层和神经纤维层。小胶质细胞位于内丛状层的顶端侧和外丛状层的顶端和基底侧。这与哺乳动物的报告不同，这表明小胶质细胞定位在丛状层内。玻璃体腔注射乌本苷后，我们发现病变区域免疫细胞急剧聚集。在3dpi时，几乎所有视网膜内神经元都被破坏，Müller胶质细胞发生反应，一些Müller胶质细胞重新进入细胞周期。许多DAPI+核存在于神经元死亡和视网膜内变性的区域，这些DAPI+核在72hpi时基本上都与免疫细胞和反应性Müller胶质细胞相对应。在乌本苷损伤视网膜中，视网膜内TUNEL+核和TUNEL+碎片出现时间为24hpi，同时伴有免疫细胞的聚集和激活，如L-plastin+细胞从分枝状到变形细胞形态的形态学变化。生理盐水注射对照组视网膜中的免疫细胞仍处于分枝状态，并且处于它们的典型位置，并且未检测到TUNEL信号。48hpi时，具有变形细胞形态的免疫细胞在相应于乌本苷诱导的神经元死亡和退化的位置继续积累。

 

受损视网膜中免疫细胞的来源和分布：为了更好地了解损伤视网膜中免疫细胞聚集的原因，我们使用标记物L-plastin和S期标记物PCNA在12hpi时对视网膜冷冻切片进行成像。盐水注射不引起免疫细胞聚集或PCNA表达。在哇巴因注射后12hpi，在视网膜中央可见变性细胞样免疫细胞，其起源于视神经头部和玻璃体到外周视网膜神经节细胞层。此时，我们没有在免疫细胞中检测到实质性的PCNA信号，这表明驻留的小胶质细胞没有立即进入细胞周期。斑马鱼巨噬细胞谱系(包括小胶质细胞)的细胞已经用mpeg1基因驱动的转基因表达进行鉴定，而中性粒细胞通过mpx的表达进行鉴定。几乎所有的L- PLASTIN +细胞与MPEG1：MCICE共同标记，表明这些白细胞大多数是巨噬细胞。在神经节细胞层的玻璃体周围白细胞群中检测到少量mpx+中性粒细胞，但在其他视网膜区域，包括视神经头周围区域，没有检测到mpx+中性粒细胞。免疫细胞浸润到受损视网膜的证据仍然在48-72hpi，但是这种后来的迁移似乎起源于神经视网膜顶端的区域和结构，这可能包括RPE或巩膜和相关的血管。我们认为情况就是这样，因为看起来定向迁移到视网膜内的免疫细胞更频繁地存在于外侧视网膜和RPE中。

 

受损视网膜免疫细胞的鉴定：确定乌本苷诱导神经元细胞死亡的免疫细胞的身份，，我们在冷冻切片中使用了吞噬性免疫细胞的细胞谱系特异性标记。表达巨噬细胞/小胶质细胞的Mpeg1在所有时间点均可见，但在这些时间点中只有一小部分L-plastin+免疫细胞也表达mpeg1转基因，支持受损视网膜的免疫细胞浸润。尽管缺乏mpeg1报告表达，受损视网膜组织中L-plastin+免疫细胞的形态学特征与巨噬细胞特性一致，包括不规则的细胞形细胞质和大量液泡的存在。使用H＆E染色，证实这些免疫细胞是巨噬细胞。

 

结论：免疫系统和中枢神经系统的相互作用已经引起了广泛的关注，这支持了免疫系统影响再生潜能的观点。为了再生受损的视网膜组织，，进一步研究成功视网膜再生过程中的神经-免疫相互作用至关重要，视网膜再生发生在包括硬骨鱼在内的各种脊椎动物生物体中。本研究为今后的研究提供了框架，证实斑马鱼视网膜是研究神经元再生过程中免疫-神经元相互作用的良好模型。揭示关键的炎症信号和先天免疫系统在视网膜再生的启动和成功执行过程中的功能。