摘要：评价了全氟己烷磺酸钾（K+PFHXS）对CD-1小鼠生殖/发育毒性的影响。交配前给予多达3mg/kg/d K+PFHxS(n=30/性别/组)，F0雄性至少42天，F0雌性至少42天，通过妊娠和哺乳。断奶后第14天用K+PFHXs直接灌胃F1仔鼠。活产仔数在1和3 mg/／kg/d时有明显减少，但幼崽出生率不受影响。观察到适应性肝细胞肥大，3mg/kg/d F0雄性伴有血清胆固醇降低和碱性磷酸酶升高。在生殖参数、血液学/临床病理学/TSH、神经行为学效应或组织病理学方面无显著发现。对F1小鼠的生后存活、发育、包皮分离或阴道开口的发生均无给药相关影响。与以前的研究相一致，我们的数据表明，PFHXs的效力远低于PFOS。

 

 

简介：亲代小鼠被称为F0代或F0小鼠；F0代的后代被定义为F1窝。从F1窝中随机选择幼崽组成F1代或F1小鼠。当参照试验化合物给药时，将使用全氟己烷磺酸钾，简称K+PFHXS。当提到解离离子形式，全氟己烷磺酸盐（例如，关于分析测量）时，将使用缩写PFHxS。1）每只性别各剂量组n＝30只小鼠。2）将F0雄性鼠重复口服给药方案延长至42天。3）添加F0雄性小鼠精子参数的测定；4）允许母鼠连续21天的泌乳，并在此期间连续给药K+PFHXS。5）延长F1幼崽至出生后第36天（PND 36），观察包皮分离和阴道开放时机； 6)以母体K+PFHxS剂量，从断奶开始直至性成熟开始，对F1幼犬直接试验K+PFHxS给药14天；7）代替测定主要代表非活性甲状腺激素的总甲状腺素（T4），对F1幼犬在出生时的多个关键生命阶段以及PND 4、21和36进行广泛的血清促甲状腺素（TSH）评估。8）进行对照组和最高剂量组的PND 36的F1幼崽的肝脏和甲状腺组织学评价。

 

动物：CD1小鼠（ICR）（n=168 /性别），购入时约54天龄。使用可编程微芯片（BMDS系统）对每种动物进行唯一识别，该微芯片在适应期被皮下植入肩胛背区。所有雄性小鼠均适应27天。所有雌鼠在发情周期的第一天之前适应13天。在驯化期间，动物每天观察死亡率和一般行为两次。在试验前对雌性进行发情周期评估，排除没有表现出正常的4-5个发情周期的雌性。健康状况良好、满足可接受的体重要求的动物，对于雌性，表现出正常的4-5次发情周期的动物被选择使用。按性别随机分为4组，每组30只，组成对照组， 0.3mg/kg/d、1mg/kg/d和3mg/kg/d剂量组。每治疗组每性别12只小鼠接受毒理动力学研究。除同居和产后外，所有小鼠均单独放置在不锈钢、实心底笼中。仔鼠出生28天后分笼。

 

赋形剂和测试药物：对照组给予赋形剂，为溶于纯水的0.5%吐温20。K+PFHxS三个剂量配方分别为0.3、1和3mg/kg/d。给药的第一天是研究第0天(SD 0)。F0名男性在合笼前14_天开始每日口服灌胃，剂量分别为0.3、1、3_mg/kg/d，至少42_天，直至安乐死。F0雌性在合笼前14_天开始接受相同剂量的K+PFHxS治疗，并在交配、妊娠和哺乳期间持续给药。F0母鼠在哺乳期第22天（LD 22）安乐死，仔鼠断奶前，在子宫内和哺乳期一直暴露于PFHxS。PND 22断奶后，相同的母体K+PFHXS剂量下，F1仔鼠直接用K+PFHXs给药14天。剂量容积(5_mL/kg)。

 

毒力动力学（TK）研究：为了提供血清和肝脏PFHxS浓度信息，将每个给药组每性别另外12只小鼠分配到毒性动力学(TK)研究中，该研究包括两个亚组，以检查雄性和非怀孕雌性、怀孕雌性和足月胎儿的毒力动力学。一个亚组(5/性别/剂量组)在预定取血前每天口服0.3、1和3mg/kg/d的K+PFHxS或赋形剂，持续14天。另一亚组(7/性别/剂量组)在合笼前接受相同剂量服药14天，雄性服药28天，次日处死。雌鼠通过交配并妊娠，在妊娠第18天（GD 18）处死。在预定的尸检中收集血清和肝脏样品。对于雄性， SD 14（5 /剂量组）和28（7 /剂量组）。雌性，包括SD 14（5 /剂量组）和GD 18（7 /剂量组）。在GD 18，收集胎儿血液和肝脏样本。。除了为交配验证目的而取得的F0雌性小鼠的发情周期状态外，没有对这些TK研究小鼠进行其他评价。

 

主要研究对象：F0亲代小鼠观察与评价：所有小鼠(n=30/性别/剂量组)在给药前和给药后约2_h观察临床毒性体征。每周对所有小鼠进行详细的临床观察和记录。对于雄性小鼠，在整个给药期间每周记录体重和食物消耗。对于雌性小鼠，在交配前和合笼期间、妊娠期间（GD 3、6、9、12、15和18）和哺乳期间（LD 1、4、7、10、14、17和21），每周记录体重和食物消耗。

 

交配发情周期：雌性小鼠中，在第一次给予K+PFHxS两周前通过阴道细胞学检查评估发情周期，然后直到合笼期间存在交配栓子证实交配完成为止。

 

对每个剂量组，对10只雄性小鼠（预定排卵前和采血前）和10只雌性小鼠（在哺乳期预定的安乐死前）进行FOB和运动活动观察。FOB评估是盲目的，评估的参数如下：笼旁观察(咬、抽搐/震颤、粪便粘稠度、眼睑闭合、姿势)；操作观察（易于操作动物，易于从笼中取出，眼突出，毛皮外观，流泪/色素沉着，粘膜/眼睛/皮肤颜色，肌张力，眼睑闭合，眼睑矫正，红色/硬皮沉积，呼吸频率/特征，唾液）。旷场观察（唤醒、后背、怪异/刻板行为、抽搐/震颤、步态、步态评分、梳理、活动、抚养、第一步时间、排尿/排便）；感觉观察（空气翻正反射，接近反应，眨眼反应，前肢伸展，后肢伸展，嗅觉定向，瞳孔反应，惊吓反应，尾捏反应，触摸反应）；神经肌肉观察（后肢和前肢握力、后肢伸展肌力、后肢足部伸展肌力、旋转肌力）；生理学观察（体温及全身瘫痪）。使用计算机控制的系统，利用一系列围绕琥珀塑料矩形笼的红外光束对每只动物的运动活动进行定量，从而自动测量其运动活动。在装有白噪声发生器、工作在70±10dB的声衰减室中进行了运动活动评估。每个动物分别进行测试，没有驯化，以捕捉最初的探索活动。在5分钟的时间内收集数据，测试会话持续时间为60分钟。

 

剖杀时间：K+PFHXS每天给药最少42次重复口服，F0雄性小鼠在最后一次给药后一天被处死。F0雌性小鼠在LD 22被处死，LD 22也是最后一次试验品给药后一天。在GD 23处死未产仔的雌性小鼠。二氧化碳窒息法应用于所有小鼠。

 

血液样品：在预定的采血日期，从异氟烷后小鼠眶后窦收集血液学标本(n=10只小鼠/性别/剂量组，随机分配)和临床化学标本(n=10只小鼠/性别/组，不同于血液学组，随机分配)。血液学参数分析包括：红细胞计数（RBC）、红细胞压积（HCT）、血红蛋白（HGB）、平均红细胞血红蛋白（MCH）、平均红细胞血红蛋白浓度（MCHC）、平均红细胞体积（MCV）、红细胞分布宽度（RDW）、血红蛋白分布宽度（HDW）、白细胞总数（WBC）、分化白细胞E计数、网织红细胞计数、血小板计数（PLAT）、平均血小板体积（MPV）和红细胞形态。用于临床化学分析的血液样品通过离心处理成血清，并评估下列参数：总蛋白（TP）、甘油三酯;（TRI），白蛋白（A）、球蛋白（G）、白蛋白/球蛋白比值（A/G）、血糖（Glu）、胆固醇（CHOL）、总胆红素、尿素氮（BUN），肌酐水平（创造）、丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、γ谷氨酰转肽酶（GGT）、B而酸（BA）、碱性磷酸酶（ALP）、钙（Ca）、磷（磷）、钠（Na），钾（K）和氯（Cl）。采用LC–MS/MS法测定血清促甲状腺激素（TSH）和血清PFHxS浓度。

 

器官重量和显微镜评估：对肝脏、肾脏、肾上腺、胸腺、睾丸、附睾、精囊、龟头、阴茎、球尿道腺、脾、脑、心脏、卵巢和甲状旁腺进行称重。称重后，每只动物每组收集两小片肝组织（200～500毫克mg）。一片肝脏在液氮中快速冷冻，LC-MS/MS分析测定PFHxS浓度，另一片保存在RNALater中进行基因转录研究。其余的肝组织连同脑、胃肠道（食道、胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠和直肠）、肺、淋巴结、周围神经、肾、脾、胸腺、气管、膀胱、脊髓、肾上腺、心脏、胰腺、垂体，腺体、唾液腺、骨骼肌、甲状腺/甲状旁腺、骨髓、前列腺、精囊、附睾睾丸、阴茎头、卵巢、子宫、阴道、主动脉、凝固腺、视神经眼睛、胆囊、乳腺、提肛球海绵肌（LABC）被保留下来用于组织学。除附睾固定于改良Davidson液中外，其余组织均浸泡于含10%福尔马林的中性缓冲液中固定。在所有收集的组织上进行光镜下的组织学评价。首先评估对照组和3 mg／kg/d剂量组。

 

生殖评估：为了评估对雄性生殖系统的潜在毒性，每个剂量组的10只雄性小鼠在SD 42时处死评估了性腺重量(右睾丸、左睾丸、左附睾、右附睾、精囊和前列腺)。附睾的睾丸在改良的Davidson溶液中保存，前列腺、阴茎头和精囊在中性缓冲的10%福尔马林中保存，用于组织学。对每个雄性(10/组)的左睾丸和尾附睾进行称重、冷冻、匀浆，同质化抗性精子计数。为了评估对雌性生殖系统的潜在毒性，每个F0雌性小鼠卵巢和子宫在LD 22的预定尸检日被取出称重。还检查了怀孕和非怀孕小鼠子宫的整个切片是否存在植入位点，如果有，记录相应数量的植入位点。对于怀孕的小鼠，子宫植入物是可视化的；对于出现未怀孕的雌性，整个子宫被硫化铵染色，该硫化铵也可以不经切片进行可视化。

 

主要研究—F1仔鼠：.观察与评价：计数F1幼崽每天一次，每日记录临床观察结果。在PND 1上记录幼崽体重，PND分别为4, 7, 10、14, 17和21。PNS分别在PND 0, 4, 14和21上进行性别鉴定。在PND 1上，测量所有F1仔鼠的肛门生殖距离（AGD），将肛门生殖距离定义为肛门尾缘到生殖结节尾缘的距离。在PND 4上，如果可能的话，将产仔数减少到4/性；对剔除的仔鼠进行血液和肝脏样本采集以进一步分析。在PND 13上，所有F1雄性后代根据Gray等人描述的方法评估胸乳头/乳晕的存在。每只母鼠和它的幼崽在PND 21上断奶前都保持在一起，这时每窝从每个剂量组中随机选择1只雄性幼崽和1只雌性幼崽组成F1代。未选择的幼崽要接受血液和肝脏样本收集以进行进一步的分析。选择的仔鼠从PND22到PND35，用同母鼠相同的剂量给药。PND 21, 24, 28，32和36进行临床观察和体重记录。以PND 22为起点观察各雄性幼崽的阴茎包皮分离情况。从PND 21开始观察每个女性的阴道穿孔。最后一次给药后第36天处死F1小鼠（PND）（通过二氧化碳窒息），检查大体病变。选择器官进行称重和记录：肝脏、肾脏、附睾、睾丸、输卵管卵巢和甲状旁腺。除了用改良Davidson’s溶液固定的附睾睾丸外，其余的肝组织和其他组织均保留在中性缓冲的10%福尔马林中。进行对照组和3 mg／kg/d剂量组的肝组织和甲状腺组织进行组织学评价。在PND 4, 21，36时收集F1血液和肝脏样品，并对PFHXS浓度进行分析。每只动物各取两小片肝组织（每只100毫克）。其中一片肝脏在液氮中快速冷冻，LC–MS/MS分析测定PFHxS浓度，另一片保存在RNALater中进行基因转录研究。

 

血清促甲状腺激素测定：采用小鼠特异性TSH酶免疫分析法测定血清样品中TSH水平：SD 42上的F0雄性，LD 22上的F0雌性，PND 4、21和36上的F1幼崽。用LC–MS/MS根据先前发表的方法测定血清、肝脏和剂量溶液中PFHxS的浓度。

 

结果：对于本研究，平均PFHxS剂量溶液浓度是均匀的，并且所有溶液都在目标浓度的10%以内。虽然每周配制给药溶液，但它们保持稳定至少14天。测定了三个不同批次的啮齿动物粪便中PFHxS的可能背景浓度，它们均低于0.5ng/g的定量下限。

 

血清和肝脏中的PFHXs浓度：在F0小鼠中，血清和肝脏PFHXS浓度有时间和剂量依赖性增加。F0雄性小鼠血清PFHxS的最高平均浓度在172μg/mL（SD 14）和188μg/mL（SD 28和42）之间。F0雌性SD 14交配前血清PFHxS平均浓度为180μg/mL，GD 18妊娠末期为111μg/mL，LD 22哺乳末期为136μg/mL。F1幼崽PND 22断奶后开始给予K+PFHXS，持续14天。F1小鼠血清和肝脏中PFHxS浓度呈剂量依赖性增加，最高血清PFHxS浓度（180μg/mL）与F0小鼠在SD 14上经14天K+PFHxS治疗后报告的浓度相似。本研究中，除3mg/kg/d雄性小鼠外，F0小鼠的平均肝-血清PFHxS比值均小于1。除3mg/kg/d剂量组的F1幼鼠外，F1小鼠相应的平均肝-血清PFHxS比值一般小于1，而3mg/kg/d剂量组的F1幼鼠肝-血清PFHxS比值在断奶前或略高于断奶前。

 

F0亲代小鼠结果: 所有F0小鼠存活到预定尸检，没有发生与试验相关的死亡率。在每日检查或给药后2小时接受对照或K+PFHxS剂量的小鼠中均未发现异常临床表现。F0雄性小鼠，实验期末平均体重在对照和所有K+PFHXs处理组之间是相似的。与F0雄性对照组相比，0.3和1.0mg/kg/d剂量组雄性小鼠总体增重显著增加，，而高剂量组则无统计学显著增加。因此，这种效果不被认为是给药相关的。对于F0雌性小鼠，在交配、妊娠或哺乳期间，K+PFHXS对体重增加没有给药相关的影响。

 

生殖功能：K+PFHXS给药对CD-1小鼠没有影响交配或生殖参数。尽管允许小鼠交配最长为14_天，但所有剂量组的实际性交前间隔都比这短得多。对照组、0.3 mg/kg/d、1mg/kg/d和3mg/kg/d平均性交前间隔天数分别为2.3±1.87、2.4±1.29、2.8±2.06和2.0±1.18。生育指数分别为： 96.7 %、90 %，93 %和83.3 %。与对照组相比，这些数据没有统计学上的显著差异。在整个研究期间给F0雄性小鼠注射K+PFHxS，每日给药不影响精子活力、计数、密度和形态。在整个研究期间，F0雌性动物每天接受K+PFHxS剂量，包括交配前、交配、妊娠和哺乳，并且每天K+PFHXS处理对交配指数、生育指数或性交前间隔没有影响。每日给予K+PFHxS对F0雌性发情周期无影响。植入的平均数，平均妊娠长度，有活力的幼崽的母鼠数量，性别比例在对照组和给药组之间具有可比性。每窝产仔的平均数量略有减少，但没有明确的剂量-反应关系。，在泌乳CD-1小鼠中，LD 21和LD 22之间的体重变化非常小。LD 21体重数据用于计算本研究中F0雌性的相对器官重量。与对照组相比，除肝脏重量外，K+PFHxS给药不影响绝对或相对器官重量。

 

显微镜评价（F0小鼠）：显微镜检查显示主要为小叶中心型肝细胞肥大，受累肝细胞呈磨玻璃样细胞质改变。这些观察的趋势检验在雄性中具有统计学显著性，并且效果更显著，特别是在3mg/kg/d剂量组。此外，在3mg/kg/d剂量组雄性小鼠肝脏中，观察到微小至轻微微囊泡脂肪改变（10只小鼠中有6只）。3毫克mg/kg/d剂量组的肝脏中也存在最小单细胞坏死。用K+PFHXS处理的雌性小鼠未见微泡性脂肪改变或单细胞坏死。3mg/kg/d剂量组的雌性小鼠(3/10)以及中剂量组的雄性小鼠中，肝细胞胞浆空泡化的发生率也较低。这种形式的肝细胞空泡化不确定成因，但很可能与代谢变化有关。

 

血液学、临床化学和血清TSH（F0小鼠）:K+PFHxS给药没有导致F0雌性小鼠血液学或临床化学参数的显著变化。K+PFHXS给药对F0雄性小鼠的血液学参数无影响。F0雄性或雌性小鼠血液学、血清肝酶、血清肾功能及血清TSH水平均无明显毒理学变化。3mg/kg/d剂量组F0雄性血清总胆固醇和胆红素值显著降低，同时碱性磷酸酶升高。FOB参数，包括自主神经功能、感觉运动功能、运动活动、兴奋性、步态或感觉运动协调、前肢和后肢握力方面，对照组和K+PFHxS处理的小鼠之间没有统计学差异。

 

F1代：PND 1的雄性和雌性幼崽测量肛门生殖器距离（AGD）。所有幼鼠的平均绝对肛门生殖器距离值均在试验设施的历史对照数据的平均值内。F1雄性幼体的乳晕/乳头内滞留不受给药的影响。在PND 13评估时，任何给药组的雄性幼崽均未保留乳头。K+PFHxS处理不影响幼犬的存活，也不影响出生时、断奶期间(哺乳期)或至PND 36时的体重。Kal+PFHXS治疗不影响阴茎勃起分离（雄性）和阴道通畅（雌性）的平均年龄。PND 21或36对肾、卵巢或睾丸绝对或相对重量无影响。在PND 21和36上，3mg/kg/d的雌雄组的相对肝脏重量也有统计学上的显著增加。