摘要：斑马鱼胚胎体外心肌细胞分化的研究尚待建立。通过对斑马鱼胚胎多能因子基因表达谱和三个胚层标记的分析，确定了斑马鱼胚胎多能窗口，研究发现，斑马鱼经历了从合子基因组激活到长方形阶段后短暂的多能性维持的非常狭窄的时期。基于多能性和适宜条件的组合，我们建立了一种快速有效的体外原代培养心肌细胞的方法。诱导的心肌细胞分化为功能性和特异性心肌细胞亚型。值得注意的是，这些体外产生的心肌细胞表现出典型的收缩动力学和电生理特征。该系统为斑马鱼初级胚胎细胞的心肌细胞分化提供了新的范例。该技术为心脏发育和再生，以及药物发现、疾病建模和心脏毒性物质的评估研究提供了新的平台。

 

 

简介：心血管疾病居首位，占全世界死亡人数的30%。不同于成年斑马鱼的心脏再生。成年哺乳动物心脏被认为是有丝分裂后的，具有极低的再生潜能。成年哺乳动物心脏被认为是有丝分裂后的，具有极低的再生潜能。有希望的治疗策略包括激活内源性心脏祖细胞/干细胞分化，通过给予化合物、修饰mRNAs、基因和重组蛋白刺激原有心肌细胞增殖、心脏祖细胞/干细胞/心肌细胞移植。为了将基于心肌细胞的治疗应用于临床，必须清楚地了解从各种细胞源向功能性心肌细胞分化的分子机制。在小鼠和人中已经建立了几种获得功能性心肌细胞的方法，包括利用发育转录因子如GATA4、MEF2C和TBX5将成纤维细胞定向重编程为心肌细胞，WT1/胸腺素激活小鼠干细胞或祖细胞诱导小鼠内源性心肌细胞增殖。然而，有许多因素和途径，包括遗传和表观遗传调控，影响这些细胞的再生功能。建立新的心肌细胞分化模型无疑将有助于我们了解心肌细胞分化的分子机制。斑马鱼心脏在切除20%心室后能迅速愈合而不结疤。因此，斑马鱼心肌分化是解释哺乳动物心脏再生分子机制的理想模型。斑马鱼心肌细胞再生的调节途径主要有Caveolin-1、Cdk9、核因子κB、端粒酶、神经调节蛋白1(Nrg1)、microRNA-101a和骨形态发生蛋白信号传导。首先用体外培养的原肠胚细胞在自发分化条件下观察收缩细胞。自发产生心脏聚集物，在体外，从幼虫斑马鱼受精后3天，每只仔鱼有0.4的心脏聚集效率。有几个问题尚待解决，例如有效的体外心肌细胞分化需要哪些条件，以及体外产生的心肌细胞样细胞是否具有功能。因此，斑马鱼心肌细胞分化的系统建模是非常必要的。本研究通过测定斑马鱼初级胚胎细胞在不同发育阶段的多能性时间，建立了一种快速有效的心肌细胞分化方法。然后对影响心肌细胞体外生成的关键因素进行了表征。还研究了收缩动力学和肌节形成。最后，对搏动细胞团（BCCS）的功能电生理特性进行了鉴定。这些发现除了对心脏发育和再生的分子机制进行剖析之外，对于开发用于药物发现、疾病建模和心脏毒性药物评估的高通量策略性药物筛选是有价值的。

 

斑马鱼、细胞和抗体：本研究采用野生型AB斑马鱼、TG（MYL7:EGFP）转基因株系和ZF4细胞系CRL－2050进行研究。免疫荧光法所用的抗体为多克隆抗体抗Acta1（1：10）和Cy3偶联二级抗体（1：100）。

 

原代胚胎细胞的分离：斑马鱼胚胎在0.003%次氯酸钠中漂白2分钟，用灭菌0.5×E2培养基漂洗，用0.1mg/mL原核酶E脱绒毛，偶尔回旋，再用灭菌0.5×E2培养基漂洗。胚胎细胞在24孔板中培养。从40～50个长方形胚中分离出每个孔中的细胞，以确保每孔中的细胞密度一致。

 

诱导心肌细胞分化：在28.5℃诱导长圆形或其他阶段的胚胎细胞向心肌细胞分化，以1～4.5×104细胞/cm2的不同细胞密度将细胞接种于平板上。培养ZF4细胞（斑马鱼胚胎成纤维细胞系），密度为2×104个细胞/CM2。用1%鱼血清、85μg/mL ZEE、30%条件培养基(ZF4 CM)、25μg/mL 胰岛素和50ng/mL EGF作为基础培养基进行原代胚胎心肌细胞分化。在评估BCCs对有丝分裂原的增殖反应时，添加重组NRG1，分别以0、50、100、200、500和1000ng/mL的浓度培养长方形胚胎细胞。在倒置显微镜下记录培养物中出现的BCC。

 

用TIZIOL试剂分离不同时期胚胎细胞的总RNA。用DNase法处理提取的RNAs。根据说明合成了第一条cDNA链。引物序列和PCR条件列于表S1中。

 

收缩动力学：用倒置显微镜上的照相机记录BCC的视频。以每秒10帧的频率从视频中提取图像。通过一系列图像跟踪收缩位点。用IMAGE软件记录位点的X和Y坐标。收缩幅度是根据收缩前后收缩位点的坐标计算的。通过将收缩或松弛距离除以持续时间来计算收缩或松弛速度。

 

电生理学：在分化第2天，用连接到口腔移液管的玻璃毛细管拾取BCC，再移植到涂有PLL的盖玻片上，并在记录AP之前保持在完整的心肌细胞分化培养基中。用PatchMaster软件驱动的HEKA EPC10放大器以全细胞膜片钳结构记录心肌细胞的AP活性。

 

结果：斑马鱼早期胚胎细胞的多能性时间：为了测定斑马鱼胚胎细胞的多能性，我们首先检测了早期胚胎细胞在不同发育阶段的形态学变化。早期胚胎细胞圆顶阶段清晰地观察到具有大小细胞的葫芦状细胞。细胞逐渐变小，直到50%。值得注意的是，在发育的各个阶段都观察到细胞质岬角，表明细胞质的不对称扩散。然后，我们对斑马鱼不同发育阶段的原代胚胎细胞中的多能性和胚层标记物进行了表达分析。RT-PCR显示多能性标记pou5f3和nanog在各个阶段均有表达，而klf17(也称为klf4b)在受精后3.5小时(受精后3.5小时)开始表达，表明合子基因组激活后的表达模式。提示母体和合子的表达.为了确定胚胎细胞分化的阶段，我们进一步研究了三个胚层（外胚层、中胚层和内胚层）的基因表达模式。外胚层标记物sox2和内胚层标记物foxa2(也称为hnf3b)均在30%外胚层期(4.9hpf)表达，中胚层标记物ta(也称为ntla)在长形期(3.9hpf)表达。胚层标记的基因表达模式以及细胞质的不对称扩散表明斑马鱼胚胎细胞系的分化最早发生在长方形阶段。因此，斑马鱼胚胎细胞经历了非常短的多能状态，从合子基因组激活到长方形阶段之后的短暂时刻。

 

从原代胚胎细胞高效分化出心肌细胞:为了开发一种利用斑马鱼原代胚胎细胞进行心肌细胞体外分化的有效方法，我们鉴定了影响BCCs产生效率的四组因素，包括包被材料、发育阶段、细胞接种密度和培养基添加物。表现为独立收缩活动的细胞群被计算为一个BCC。在培养的第2天，BCCS的总数量与分化程度无关。通过比较每个胚胎产生的BCCs数量，我们评价了纤维蛋白凝胶（FG）、聚L-赖氨酸（PLL）、明胶（GEL）、饲养层ZF4细胞（ZF4）或对照（无）等培养皿上添加材料对长方形期胚胎细胞心肌细胞分化效率的影响。结果表明，ZF4细胞共培养对BCC生成最有效，PLL组和GEL组均产生较多的BCC。其次，我们比较了不同发育阶段（包括256细胞、高细胞、长方形、穹顶、30%外延、50%外延和70%外延）的胚胎细胞在明胶包被板上的BCC生成效率，以确定心肌细胞分化的最佳阶段。与其他阶段相比，长方形阶段的胚胎细胞对心肌细胞的生成效率最高。在先前的研究中，由于胚胎干细胞的培养密度改变了其分化的命运，因此我们研究了细胞的培养密度对其心肌细胞诱导电位的影响。我们观察到，在1～2×104个细胞/CM2密度范围内接种的细胞比其它密度的产生BCC量高。高密度的初级胚胎细胞导致大细胞聚集体的形成，最终没有分化成心肌细胞。因此，胚胎细胞的接种密度对于有效的BCC产生是重要的。最后，我们评估了表皮生长因子（EGF）、斑马鱼胚胎提取物（ZEE）、ZF4细胞条件培养基（ZF4 CM）和胰岛素等辅助因素对心肌细胞诱导的影响。从各组培养基配方中去除单一因子后，胰岛素影响BCC产生效率，ZEE或ZF4 CM去除也降低了效率，而EGF不影响。0、10、25和50μg/mL浓度时，添加胰岛素对诱导效率有剂量依赖性影响，在诱导开始时添加胰岛素的效果更好。因此，以1-2×104细胞/cm2、ZF4饲养细胞、以及ZEE、ZF4 CM和胰岛素补充物组合培养长圆形阶段胚胎细胞，可获得心肌细胞分化的最大诱导效率。利用这个条件，我们观察到BCCs可以在诱导后28小时内出现，并且BCC的数量在第二天达到高峰。部分BCC在分化8天后收缩活性下降，而其他BCC则保持博动长达20天。

 

搏动细胞团的形态和收缩动力学：为了进行形态学观察，我们利用上述最佳条件进行诱导培养，并观察不同时期BCC的形态学变化。第1天和第2天的BCC大部分是不规则的球形、梭形或长梭形。随后，BCC逐渐扩散，收缩区域扩大，最后形成有节奏跳动的细胞片，持续20天以上。然后测量BCCS的收缩/松弛速度和振幅。收缩速度高于舒张速度，收缩幅度维持在1.8±0.1μm持续20天。这些BCCS在第一天缓慢跳动（29.6±1.3 BPM），然后以59±0.5 BPM的速率快速跳动。这些动力学特征可与人干细胞来源的心肌细胞相媲美。

 

心脏标志物表达与肌节形成：为了研究胚胎细胞分化诱导过程中的基因表达模式，我们分析了多能性、胚层层、心脏祖细胞和心肌细胞四种类型的标记。RT-PCR结果显示KLF17和NANGG仅在第2天表达，而POU5F3表达逐渐减少。 对于胚层标记，外胚层基因（sox2、nestin和pax6a）在第4天开始表达，然后内胚层（sox17和foxa2）基因跟随其表达，而中胚层标记ta的表达在第0-16天可检测到。我们进一步研究了心肌祖细胞和心肌细胞的标记表达。心脏祖细胞(gata4、tbx5a和nkx2.5)的基因从第1天开始表达，心肌细胞标记物（TNTT2A、MYH6和VMHC）在第2天出现，除MYL7外，第1天表达。事实上，这些分子（NKX2.5和TNNT2A）在胚胎发育早期没有表达。这些结果表明在心肌细胞诱导过程中，心脏祖细胞和心肌细胞已经产生，多能性降低。为了研究肌小球的形成，我们利用myl7:EGFP转基因原代胚胎细胞进行BCC生成，从而能够评估心肌细胞分化过程中心肌标记物myl7的表达。第2天时，骨骼肌肌动蛋白免疫染色在BCC中显示连续的点状信号，表明肌节细胞早期聚集。在第6天某些BCC中可以观察到连续的带状信号，在第9天和第14天一些散在的BCC中可以检测到典型的肌节I带，表明成熟的肌节形成。来源于原代胚胎细胞的BCCs表达了祖细胞和心肌细胞的心脏标志物，并且在诱导的心肌细胞中呈现出动态的肌节成熟过程。

 

BCCS显示功能电生理特征：为了解决产生的BCC是否具有心肌细胞的功能特征的问题，我们首先使用膜片钳放大器记录其自发全细胞动作电位（APs）。三种典型的AP模式，即室样、结节样和心房样，在BCCS中观察到。具有室样APS的BCC表现出快速的上冲程和明显的高原相。因此，诱导可以产生三种典型的心肌细胞亚型，具有不同的心脏自发AP模式。