基因敲除（转基因）小鼠是指遗传修饰过的实验室小鼠，它们的某些基因失活、去除或人为引入。在研究某些基因的功能时，它们已成为不可或缺的一部分，从癌症探索到成瘾研究。研究人员通常在敲除某个基因之后，观察小鼠的行为、健康状况和生物标志物，为基因功能提供线索，从而了解疾病和行为背后的机制。

 

1989年，Mario Capecchi、Martin Evans和Oliver Smithies创造了第一只基因敲除的小鼠，这也让他们在2007年获得了诺贝尔生理学/医学奖。基因组编辑在近几年获得广泛关注，CRISPR-Cas9更是频频登上头条。不过，另一种技术也不容忽视，它利用电穿孔来打通细胞膜，将DNA等分子引入细胞。

 

电穿孔（electroporation）一种将电场施加到细胞膜上以增加其渗透性的方法。这允许DNA等分子通过电穿孔在膜上形成的小孔而进入细胞。在建立基因敲除小鼠的过程中，它也是重要的一环。

 

 

当然，基因敲除小鼠模型也存在局限。比如小鼠发育和基因型鉴定需要时间，而小鼠基因组的其他部分也可能带来表观遗传影响。然而，由于它们的制备过程相对简单，并且它们在研究中无处不在，因此基因敲除小鼠已经成为近年来遗传研究中最成功的动物模型。

 

基因敲除小鼠

 

2007年，犹他大学医学院的Mario Capecchi教授及其同事详细介绍了基因敲除小鼠的制备方法，详见诺贝尔奖的官方网站。这个过程中的两个重要步骤：设计（基因编辑）和导入（电穿孔），在近几年都迅速发展。

 

人们通常要设计目标载体，包括从基因文库中分离待敲除的基因并设计一段新的序列，这段序列要彻底改变，表现为无活性，但又要足够相似，以便掺入到小鼠目标序列中。另外，人们还添加标记基因，如荧光报告基因或neo基因，这些基因产生可观察到的变化，便于进一步的选择。近年来，CRISPR-Cas9、ZFN和TALEN已成为转基因生物开发过程中最成功的基因编辑方法。

 

研究人员随后利用电穿孔或显微注射将重组载体导入胚胎干细胞，使外源DNA 与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA 序列整合到内源基因组中，从而实现表达。一般来说，显微注射命中率较高，但技术难度大，电穿孔命中率比显微注射低，但便于使用。

 

最近，日本京都大学和广岛大学的研究人员在《Scientific Reports》杂志上介绍了一种新方法 – 通过电穿孔来获得基因敲除动物的技术（TAKE）。这种方法通过电穿孔直接引入经过修饰的核酸内切酶，从而获得基因敲除的大鼠。

 

在这项研究中，研究人员使用了NEPA 21电穿孔仪。这种仪器采用三步脉冲：第一个脉冲在细胞膜上形成小孔，第二个脉冲将目标序列送入胚胎，而第三个改变极性，以确保导入整条mRNA序列。结果表明，电穿孔方法使得胚胎存活率达到91%，基因组编辑率达到73%，与传统的显微注射方法相比都提高了两倍以上。

 

有时候，基因编辑的进步也需要电穿孔方法的配合。加州大学伯克利分校的研究人员最近开发出一种名为CRISPR-EZ的新系统，它已被证明能够以100%的效率将CRISPR修饰的基因导入小鼠胚胎。

 

这项研究成果发表在《Journal of Biological Chemistry》杂志上，展示了如何将新的基因编辑技术与电穿孔方法相结合，才能更有效地生成转基因模型。

 

一些转基因CRISPR研究的传统做法是通过显微注射将CRISPR-Cas9导入目标胚胎。这种方法通过修饰胚胎本身的DNA来缩短基因敲除小鼠的制备过程。然而，显微注射会导致胚胎的活力低，并且既昂贵又耗时。为了克服这一点，研究人员利用电穿孔将CRISPR导入胚胎，产生了更多的转基因小鼠。这主要是因为与显微注射的胚胎相比，电穿孔胚胎的活力增加。

 

这种方法不仅更有效，也更经济。作者认为：“在过去，至少需要花费25,000美元和6个月的时间来制备基因敲除小鼠。通过CRISPR-EZ等改进，成本和时间都至少下降10倍。这些技术创新让小鼠成为人类疾病建模的强大工具。”

 

其实，不光是基因编辑，还有基因插入，它们推动了基因敲除动物的技术进步。眼下，这些快速发展的领域相互配合，加速了世界各地的研究进程，从而帮助人们应对健康领域面临的挑战。

 

相关文献

 

1 Kaneko T, Sakuma T, Yamamoto T, Mashimo T. Simple knockout by electroporation of engineered endonucleases into intact rat embryos. Sci. Rep.  4, 6382 (2014).

 

2 Chen S, Lee B, Lee AYF, Modzelewski AJ, He L. Highly efficient mouse genome editing by CRISPR ribonucleoprotein electroporation of zygotes. J. Biol. Chem. 291, 14457–14467 (2016).