摘要：视网膜的病理性血管生成是失明的主要原因。血管内皮生长因子是视网膜血管疾病的主要血管生成诱导因子，其靶向治疗手段存在明显的局限性。因此，视网膜新生血管的实验模型仍然是研究新的抗血管生成策略并将其带给患者的关键。最近的观察表明，斑马鱼胚胎的眼部新生血管化可能是鉴定血管生成抑制剂的新靶点。这篇综述强调了斑马鱼胚胎作为筛选抗血管生成分子用于治疗血管生成依赖性眼病的创新模型系统。

 

 

简介：病理性视网膜血管生成是导致儿童和工作年龄人群视力损害并发症的主要原因。新生血管生长在视网膜表面，延伸到玻璃体凝胶和晶状体，失去正常的分支结构。这导致严重的并发症，包括玻璃体出血、牵引性视网膜脱离、黄斑水肿，最终导致视力丧失。促血管生成因子在增生性视网膜病变发病机制中的作用是至关重要的，血管内皮生长因子（VEGF）是研究最多的相关因子。因此，抗VEGF策略可作为经典激光光凝的替代方法。已经研制出三种VEGF阻断剂，第四种药物贝伐单抗用于非标记药物。然而，抗VEGF治疗的局限性确实存在，因为VEGF驱动途径只是调节眼睛血管生成的复杂机制的一部分。事实上，其他因素的产生可能会导致抗VEGF治疗的耐药性，从而限制其疗效。因此，需要针对调节眼血管生成的不同途径识别新的抗血管生成策略的新方法。视网膜血管生成已被广泛研究使用各种小鼠模型，其中可以进行药理学研究。然而，这些模型的应用受到一些限制，并且已经建立了适合大规模筛选小型抗血管生成化合物的体外和离体工具。斑马鱼是研究生理和病理血管生成机制的有效替代动物模型。最近的观察显示，斑马鱼的眼睛新生血管化可能代表了验证血管生成抑制剂的合适平台。这篇综述强调了斑马鱼胚胎作为筛选抗血管生成分子用于治疗血管生成依赖性眼病的创新模型系统。

 

视网膜血管疾病：视网膜和脉络膜新生血管是严重眼病如早产儿视网膜病变（ROP）、糖尿病视网膜病变（DR）、年龄相关性黄斑变性（AMD）和视网膜静脉阻塞（RVO）视力丧失的主要原因。ROP是西方儿童失明的主要原因。ROP发生在早产儿中，是一种双相性疾病，包括血管丢失的初始阶段，接着是血管增生的第二阶段。新生血管在视网膜血管与无血管区的交界处生长，产生涉及视网膜、玻璃体和晶状体的纤维性瘢痕。治疗包括通过冷冻疗法或激光光凝术消融周边无血管视网膜，尽管也可使用抗VEGF药物。然而，激光消融并不完全有效，抗VEGF化合物可能具有损害未成熟视网膜的副作用。DR是糖尿病的主要并发症，也是工作年龄人群视力损害的主要原因。它开始于非增殖性微动脉瘤，发展为增殖性糖尿病视网膜病变（PDR），特征为软性渗出物和硬性渗出物、出血和新血管形成。视网膜微血管网的渐进性损伤导致组织缺血、缺氧诱导因子-1(HIF-1)上调、VEGF分泌的刺激，并最终导致PDR，其诊断依据是存在新生血管或视网膜/玻璃体前出血。DR的特征是血管生成与炎症之间的紧密串联，炎症反应促进新生血管，反之亦然。尽管激光光凝可以长期恢复新生血管，但抗血管生成药物被广泛使用。无论如何，完全解决治疗的识别仍然是富有挑战性的。AMD是导致视功能障碍的多因素进展性黄斑病变，根据渗出物的缺失或存在分为“干”和“湿”两大类。湿性病变更为严重，其特点是脉络膜在黄斑视网膜色素上皮（RPE）后面生长血管。尽管目前还没有治愈AMD的方法，但是光动力疗法和抗VEGF药物可以预防严重的视力丧失并减缓疾病的发展。RVO是继DR之后的第二最常见的视网膜血管疾病，并且由于黄斑水肿和/或视网膜缺血的发展可能导致失明和视力受损。RVO患者接受激光光凝和玻璃体内注射抗炎药治疗，尽管两种方法都不是确定的。事实上，激光治疗只会减少黄斑水肿而不改善视力；与视力方面更好的结果相关的药物治疗增加了眼压以及青光眼和白内障的风险。

 

血管因子作为病理性视网膜血管生成的治疗靶点：VEGF是参与血管生成和血管通透性的主要细胞因子之一。实验和临床证据表明，新生血管疾病视网膜缺血导致其眼内水平升高。此外，VEGF水平与血-视网膜屏障的破坏、血管通透性增加以及新生血管有关。这些观察结果导致了这样的假设，即抗VEGF药物可以阻止甚至逆转血管生成依赖性眼病的进展。尽管抗VEGF干预比替代治疗显示出更好的结果，但抗VEGF治疗的局限性确实存在。由于作用时间短，玻璃体内注射需要相对较高的频率。这可能会导致局部和全身不良反应，如眼部炎症和眼内炎。此外，在很多患者中观察到的不良反应提示，VEGF驱动途径只是调节眼内血管生成的复杂机制的一部分，并且其他因子的产生可能导致对抗VEGF治疗的抵抗并限制其疗效。除VEGF外，多种血管生成和炎性因子的局部生成可能导致病理性视网膜新生血管形成。

 

斑马鱼作为人类疾病研究的模型：斑马鱼在过去几年中已被广泛用于揭示胚胎发育中涉及的生物和分子途径，作为研究人类疾病的替代平台。与其他动物模型相比，斑马鱼具有操作简单、维护成本低、光学透明度高、后代数量多等优点。调控发育中的斑马鱼胚胎基本血管的基因和机制与其他脊椎动物有显著的相似性。在斑马鱼胚胎发育的最初几天，血管树的结构非常简单，因此允许使用高分辨率成像和操纵技术。

 

斑马鱼眼部病理性血管生成：斑马鱼胚胎眼部血管的发育：在斑马鱼胚胎中，发育的眼睛被短暂的玻璃体和浅脉络膜血管系统灌注。玻璃体动脉（HA）、玻璃体静脉（HV）和毛细血管网构成玻璃体系统。HA起源于视动脉（OA），HA起源于视动脉（OA），在受精后18-20小时作为fli1+前体细胞进入脉络膜裂而浸润眼睛。在随后的几个小时内，HA生长并分支成毛细血管，形成围绕晶状体内侧部分的篮状结构。迄今为止，已经发现了多种基因调节了玻璃体系统的发育。有趣的是，与晶状体或视网膜形成有关的基因已被鉴定为选择性玻璃体/视网膜血管决定因子。的确，它们的敲除或敲除对其它血管区（例如躯干的毗邻血管）的形成无效，因此显示出促进不同器官血管生成过程的分子机制的异质性。与玻璃体系统的形成平行，在随后的2天中，浅层系统在视网膜表面开始发育，导致脉络膜血管的形成。浅层系统覆盖在视网膜色素上皮上，由三个主要血管组成，三个主要血管由一条环形血管相互连接。. 尽管静脉起源，三支血管之一在生长过程中获得动脉身份，作为浅系统动脉。72hpf时眼循环清晰可见，实验证明斑马鱼胚胎眼新生血管与血流无关。在受精（dpf）后5天，玻璃体血管系统的毛细血管篮完全包围晶状体，并在随后的几天中逐渐分支，形成复杂的血管网络。在60 DPF，斑马鱼幼体的眼部血管与成人基本相同。尽管有几个共同的特点，人类和斑马鱼眼睛血管呈现出一些差异。例如，斑马鱼玻璃体血管逐渐远离晶状体并与视网膜相关。相比之下，在玻璃体血管退行伴随视网膜血管新生的人类中，这个过程是截然不同的。 此外，与人类不同，在斑马鱼玻璃体-视网膜血管系统中没有发现星形细胞网络的证据。此外，玻璃体-视网膜血管虽然与神经节细胞层直接接触，但在成人中不形成视网膜内丛。

 

斑马鱼与人类血管性眼病：如上所述，尽管鱼类和人类之间的解剖和发育差异，斑马鱼已经成为一个适合人类眼部疾病研究新的动物模型，可应用于眼科疾病的药物筛选。斑马鱼的眼睛发育始于12 HPF，胚胎从72个HPF开始显示功能性视觉系统。此外，斑马鱼的眼睛发育明显快于小鼠，在某些方面，它比鼠类模型更好地模拟人类情况。例如，与人类相似，斑马鱼表现出白天的视觉，而不是夜间视觉。因此，斑马鱼已经建立了以血管化缺陷为特征的各种视网膜病变模型。缺氧和缺氧相关的血管事件在视网膜病变中起着重要的作用。在此基础上，将成年fli1:EGFP动物暴露于缺氧水3～10天，建立了斑马鱼缺氧性视网膜病变模型。该模型已用于检测抗VEGFR2药物舒尼替尼和ZN323881的活性，它们能够高效地抑制缺氧诱导的新生血管。类似地，为了模拟ROP的机制，斑马鱼胚胎暴露于氯化钴诱导缺氧，然后在新生血管开始之前用VEGF诱导剂处理。治疗增加了斑马鱼胚胎视网膜中央血管分支和芽，并且通过抑制VEGF/VEGFR系统恢复了这种表型。斑马鱼VHL突变体是血管性视网膜病变的另一种模型。斑马鱼vhl突变体显示脑、眼和躯干的血管异常生长，同时vegf和cxc4a表达上调。此外，在vhl/胚胎中发现脉络膜和玻璃体血管新生，并伴有血管渗漏、严重黄斑水肿和视网膜脱离，这与PDR和AMD患者的缺陷相似。家族性渗出性玻璃体视网膜病变（FEVR）是由不同基因突变引起的遗传性常见眼病，其特点是外周视网膜血管化异常，导致严重的视力损害。在FEVR患者中发现了锌指蛋白408中的一个新的错义突变，并且被建议作为另外的致病突变。吗啉驱动的斑马鱼znf408基因敲除导致视网膜径向血管严重缺损，同时伴有异常的主干血管形成。重要的是，通过联合注射人ZFN408野生型mRNA，完全挽救了该表型，但未通过突变的同型型，证实了该变异体的致病性。斑马鱼胚胎还可以识别与眼部血管疾病相关的脊椎动物基因。可以使用斑马鱼成虫和胚胎模型来研究DR。可通过每隔24小时至30天交替暴露于2%和0%葡萄糖溶液中获得高血糖斑马鱼。在这些条件下，斑马鱼产生类似于其他糖尿病动物模型中描述的缺陷。实际上，高血糖斑马鱼成鱼视网膜的特征是锥形光感受器神经元的破坏、视网膜毛细血管增厚以及血-视网膜屏障的形态完整性的改变，这是非增殖性DR早期阶段的标志。该模型首次强调了神经元和血管功能障碍在DR中能够独立出现。在不同的模型系统中，用高葡萄糖浓度处理3天大的斑马鱼胚胎会模拟DR的血管改变。事实上，在葡萄糖暴露3天后，斑马鱼幼虫显示出玻璃体视网膜血管的扩张，以及紧密连接蛋白和VEGF表达的变化。由于具有从水环境中吸收溶质的能力，这两种高血糖斑马鱼模型均可适用于筛选用于DR治疗的药物。

 

斑马鱼眼部新生血管作为新血管生成抑制剂的鉴定平台：筛选新的抗血管生成化合物的理想试验应涉及在其自然环境中生长的血管，如活的整个有机体。如上所述，与其他动物模型相比，斑马鱼胚胎具有若干优点，包括所测试的化合物可以直接添加到鱼水中。最近的实验证据表明，与体外/离体平台类似，斑马鱼胚胎的化学测试能够发现治疗眼血管疾病的新型抗血管生成药物。例如，SU5416给药导致玻璃体血管生长严重减少而不影响胚胎主干血管。此外，PI3K抑制剂LY294002选择性地抑制斑马鱼幼虫的眼血管生长而不损害视网膜形态和视觉功能。此外，通过筛选小分子，已经鉴定出能够抑制斑马鱼胚胎眼血管生成的新化学物质。尽管斑马鱼胚胎能够从鱼水中提取溶质，但被测化合物的理化特性和/或分子量可以防止其扩散到动物体内。合成肽Ac-L-Arg-Aib-L-Arg-D-Cα(Me)Phe-NH2(UPARANT)是尿激酶型纤溶酶原激活物受体(uPAR)的抗蛋白酶抑制剂，具有抑制VEGF依赖性血管生成的能力。然而，UPARANT并不影响斑马鱼胚胎在鱼水中的血管发育。显微注射22 HPF TG（FLI1：EGFP）斑马鱼胚胎静脉窦的实验研究在1和10 fmoles /胚胎剂量范围内显著抑制EGFP+玻璃体血管的生长。此外，这些胚胎中节间血管的萌发也受到延缓，并伴有胚胎体的微小形态缺陷。在斑马鱼胚胎的血流中微量注射可以代表获得某些不能自由扩散到胚胎体中的化合物的适当递送的必要和有效的程序。

 

结论：已经开发了各种动物模型来研究血管生成过程和筛选促血管生成的和抗血管生成的化合物，用于治疗血管生成依赖性疾病，包括眼部病理学，每个都有其独特的特点和缺点。先前的研究表明，斑马鱼胚胎中发育性血管生成可能是筛选抗血管生成化合物的一个靶点。在这些试验中，研究了溶解于鱼水中或注射到血流中的低分子量化合物，其对由内源性、发育调节信的复杂网络驱动的新血管生长的影响。综上所述，斑马鱼胚胎的眼部新生血管可能是鉴定血管生成抑制剂的新靶点。.与其他体内试验相比，斑马鱼胚胎可能代表一种简单、成本效益高和快速的工具，用于研究新的抗血管生成疗法和鉴定与眼血管疾病相关的基因。反过来，可能成为开发新治疗方法的目标。