摘要：由于小型猪与人眼的解剖结构相似，并且作为非人灵长类动物的替代品，在眼毒理学研究中使用小型猪的趋势日益增加。这需要光学相干断层扫描（OCT）和眼部相关组织免疫组织化学（IHC）或原位杂交（ISH）标记。在本研究中对成年小型猪进行OCT和OCT血管造影。为了增加视网膜和脉络膜血管结构的信息，对OCT数据进行斑点去噪，并用阈值滤波对脉络膜血管进行分割。此外，在石蜡包埋的小型猪眼睛上建立了一套IHC和ISH标记：神经纤维瘤160、神经元核、钙网膜蛋白、蛋白激酶Cα、波形蛋白、胶质纤维酸性蛋白、谷氨酰胺合成酶、离子化钙结合分子-1、视紫红质、突触素、突触后密度蛋白-95、视网膜色素上皮（RPE）特异性蛋白65、α-平滑肌肌动蛋白、结蛋白和Ki-67，从而能够显示视网膜神经元和胶质细胞、光感受器、突触、RPE、血管、肌细胞、巨噬细胞或细胞增殖。使用ISH，血管内皮生长因子A、血管生成素-2和内皮酪氨酸激酶的转录物被可视化。本文首次报道了小猪眼睛斑点噪声——无斑点OCT、血管OCT及Davidson石蜡包埋固定组织上的一组IHC/ISH标记物，为建立小猪眼毒理学和药理学研究奠定了基础。

 

 

简介：为了减少非人类灵长类动物的使用，我们越来越多地考虑将小型猪用于毒理学研究，包括研究眼部药物传递途径。此外，小型猪是一种有趣的眼科研究物种，可译到人类疾病的条件下，例如青光眼，视网膜色素变性，增殖性玻璃体视网膜病变，脉络膜新生血管，视网膜变性或脱离，在移植研究中，作为糖尿病视网膜病变选择性视网膜毛细血管阻塞模型。由于猪和人眼在解剖和功能上的相似性，先进的人眼科诊断技术可以得到应用。由于光学相干断层扫描（OCT）可作为体内生物标记物用于纵向评估和补充组织病理学，因此在眼毒理学研究中用于安全性分析越来越引起人们的兴趣。这种非侵入性技术以近显微镜分辨率获得眼部结构的实时图像，这些图像可高度翻译给临床。尽管OCT成像不断地提供了人类医学视网膜区域的更详细的信息，由于缺乏穿透或通过吸附或散射造成的信号损失，诸如脉络膜的更深的后眼层仍然难以显示。脉络膜的研究对于年龄相关性黄斑变性、中心性浆液性脉络膜视网膜病变、肿瘤、糖尿病、青光眼或多发性硬化的诊断和治疗具有重要意义。随着增强深度成像（EDI）技术的引入，脉络膜可以用光谱域OCT进行更详细的成像。先进的扫描源OCT的主要优点是速度更快，组织穿透更深，从而可以改善脉络膜的分析和重建。然而，斑点噪声-模糊的脉络膜微血管的可视化仍然是OCT成像的主要缺点。最近，OCT血管造影作为一种新的无染料方法被引入，它能够利用深度分辨信息对视网膜和脉络膜血管进行三维可视化。关于体内OCT扫描结果与猪眼组织病理学的相关性的知识正在增加。无斑点噪声的OCT技术，包括SSOCT和血管OCT还没有关于猪的描述。在毒理学研究中，眼部改变的特征取决于眼科检查和由特殊技术支持的组织病理学，包括免疫组织化学（IHC）或原位杂交（ISH）。我们的工作有两个目的：（1）首次证明无斑点噪声OCT和无染料血管OCT在改善小型猪视网膜脉络膜血管系统活体可视化中的适用性，这些可常规应用于临床前研究。（2）显示一组基于组织的IHC或ISH标记物在DF固定的石蜡包埋的小猪眼神经元和胶质细胞、光感受器、突触、视网膜色素上皮(RPE)、巨噬细胞、血管和细胞增殖方面的适用性，同时在毒理学研究中保留良好的形态学以进行眼部的详细组织病理学检查。

 

动物：本研究使用2雄，4雌成年小型猪。动物为15至33个月大，体重在14至24公斤之间。小型猪成对饲养，并配有背景音乐。每隔3至4周进行眼科检查，每只动物高达4次。在昏暗的房间里进行前后眼节段的OCT扫描。将250mg替他明和250mg唑拉西泮分别溶于6.25ml二甲基拉嗪（20mg/ml）、1.25ml氯胺酮（100mg/ml）和2.5ml布托啡诺（10mg/ml）对动物进行肌肉注射镇静(1 ml/15 kg).心率和外周血氧饱和度在整个成像过程中被监测并维持在正常水平。麻醉过程中通过静脉补液(10 ml/kg/hr)。用眼睑扩张器固定眼睑，用5%托吡卡胺眼药水扩张瞳孔。角膜润湿是通过频繁应用润眼喷雾剂进行的。OCT成像使用2种不同的激光系统，在EDI模式下，在8.6 mm×5.7 mm×1.9 mm、261多行扫描型截面和10帧自动实时采样的范围内测量SDOCT体积。采用三维扫描方式对SSOCT立方体进行成像，面积6.0mm×6.0mm，扫描密度512×128，交叉扫描256次。眼睛的正确定位是通过移动头部以获得一个以视盘为中心的矩形扫描轴来实现的。聚焦扫描光束被手动或自动聚焦于SDDOT或SSOCT系统。根据所述方法对OCT数据进行散斑去噪以增加结构信息，并用阈值滤波对脉络膜血管进行分割。

 

组织病理学：4头小型猪用250mg替他明和250mg唑拉西泮，溶于6.25ml西拉嗪（20mg/ml）、1.25ml氯胺酮（100mg/ml）和2.5ml丁酚（10mg/ml）进行深度镇静。通过静脉注射约120mg戊巴比妥/kg体重的过量剂量，动物放血后，立即获取眼睛。每个眼球用200ml市售Davidson溶液浸泡固定48小时，通过瞳孔在垂直中矢状面切片，包括视盘，石蜡包埋，常规组织学方法处理。HE染色切片光镜下观察，所有小猪眼形态均正常。

 

结论：脉络膜视网膜血管和视盘的OCT成像：垂直椭圆形视神经头及其中央苍白凹陷（视杯），白色的盘缘，深黑色的下缘，中等大小的视网膜血管进入杯中，和一些较大的视网膜血管。脉络膜血管位于视神经盘周围，呈环状排列。血管OCT显像显示较大视网膜血管之间的浅层、致密、丝状毛细血管网，这些浅血管似乎沿着视网膜神经纤维的方向径向地朝向视盘。较小的分支血管以90°或更频繁的角度出现，呈锐角。视网膜毛细血管复合体由蜂窝状毛细血管床组成。脉络膜毛细血管以较均匀的结构出现，由脉络膜下血管引起的交错带。视盘边缘波状起伏。视神经头部的一些凹陷代表筛板的浅孔。小型猪眼后段横断面OCT显像显示毗邻玻璃体外皮质的视网膜区界限清晰，由平行于视网膜表面的多条致密超反射线组成。浅表较大的视网膜血管突入真皮层，表现出典型的后信号丢失。脉络膜血管表现为低反射孔。去除了正常视网膜结构的主要畸变，消除了斑点噪声。它使得结构轮廓增加，组织与充液腔之间的分界更好，从而促进脉络膜血管的提取。在3D密度OCT图像中，视网膜和脉络膜血管位于彼此之上。脉络膜血管提取通过后处理阈值过滤没有发现任何脉络膜血管环，可以清楚地彼此分开。此外，血管碎片之间的连接似乎部分中断，特别是在重叠血管和弱OCT信号的区域。斑点噪声在EDI-SDOCT和SSOCT图像中的分布不同。

 

用Ki-67抗体显示细胞增殖，在细胞增殖过程中染色质凝集的单个角膜基底上皮细胞中检测到强特异性核免疫染色。使用抗von Willebrand因子的抗体，在包括脉络膜在内的所有眼室毛细血管内皮细胞、小血管和大血管中均检测到强特异性免疫标记，但在晶状体或角膜中没有检测到。α-SMA是平滑肌和肌成纤维细胞的标志物，定位于包括脉络膜和神经视网膜内部结构的所有眼室血管的平滑肌壁。但不在晶状体或角膜。此外，α-SMA在睫状肌和虹膜括约肌和扩张肌中均有表达。使用抗Iba1的抗体，在视网膜内区检测到小胶质细胞，主要分布在INL中，其突起延伸到GCL、INL和OPL。用抗突触素和突触后密度蛋白95的抗体证明了视网膜OPL和IPL中的突触。用抗突触素作为视网膜突触完整性标记的免疫标记显示OPL中的感光细胞终端和IPL中的双极细胞终端的强特异性染色。此外，ONL和INL和感光器内段的染色较弱。同样，突触素阳性存在于大脑中用作阳性对照的神经元中。抗PSD95标记仅在视网膜OPL中突出和强烈。

 

结论：我们能够演示无斑点噪声的OCT成像和无染料血管OCT，从而能够改善视网膜和脉络膜血管的可视化。我们对不同的基于组织的IHC或ISH标记物的研究有助于了解适用于小型猪DF-固定眼组织的IHC和ISH标记物。这对于全身和眼毒理学研究及猪眼动物模型的研究具有重要意义。通过OCT对脉络膜和视网膜病变进行纵向评估和监测以适当评估小型猪的组织病理学病变。从OCT成像、标准组织病理学和IHC/ISH研究结合中获得的知识将有助于小型猪作为人类脉络膜和视网膜转换模型。