摘要：在本研究中，我们评估口服核黄素联合全身紫外线A（UVA）照射对豚鼠模型巩膜生化和生物力学性质的影响，以控制近视的进展。实验组在近视眼模型制作前3天及模型制作过程中给予含或不含维生素C的0.1%核黄素溶液。豚鼠在每次灌胃2周后进行全身UVA照射30分钟。对照组给予豚鼠维生素C，在没有0.1%核黄素溶液的情况下进行全身UVA照射或全身荧光灯照射，含或不含0.1%核黄素溶液。结果，随着眼轴长度和近视屈光度的增加，建立近视模型。与对照组近视眼相比，实验组眼轴长度、屈光度及应变评定的净增加量显著减少，巩膜厚度、极限负荷和应力评定的净减少量显著减少。MMP-2表达降低，TIMP-2表达降低。此外，实验组近视眼巩膜成纤维细胞增生更为活跃。结果表明，在豚鼠近视模型中口服核黄素加全身UVA照射，可改变巩膜的生化和生物力学性质，提高巩膜的强度和硬度，轴伸长和近视屈光度降低更大。

 

 

简介：近视，尤其是高度近视，与最终导致失明的主要眼科疾病有关，如渗出性近视性黄斑变性、孔源性视网膜脱离、近视性视网膜病变和青光眼。近视的机制尚不完全清楚，但许多研究人员认为巩膜表现为“代谢紊乱”。各种先天和后天因素导致巩膜变薄并在眼压下扩张，导致眼球变形，如后巩膜局部扩张，导致近视。实验性近视眼的动物实验表明，近视眼巩膜组织与正常眼巩膜组织相比，机械硬度降低，蠕变顺应性增加。近年来，提高巩膜的强度和刚度以稳定眼组织正常形态的概念引起了人们极大的研究兴趣。用紫外线A（UVA）照射和核黄素滴眼液进行体内处理，Wollensak和Iomdina报道了用紫外线A(UVA)照射和核黄素滴眼液在体内处理Chi.lla兔眼赤道巩膜的一个区段的应力-应变测量，提出UVA和核黄素诱导的巩膜胶原交联可提高生物力学强度和巩膜刚性。核黄素敏化的光反应产生自由基和活性氧，如单线态氧、超氧化物或超氧阴离子自由基，在UVA下诱导胶原交联。核黄素/UVA巩膜胶原交联技术是一种提高巩膜机械强度的新技术，为加强巩膜组织，从而为抑制近视的进展提供了理想的途径。然而，这些使用核黄素和UVA的实验需要外科手术暴露巩膜产生有限的照射面积。因此，我们评估了全身UVA照射加口服核黄素对近视豚鼠巩膜生化和生物力学特性的影响，以开发一种独特的、无创的、实用的治疗方法来控制近视的进展。本文首次报道了在近视眼巩膜无手术暴露的情况下全身UVA照射和核黄素治疗的效果。

 

动物：对30只豚鼠（均为雌性，4周龄）右眼-10.0D凹透镜治疗2周建立近视模型。凹透镜为-10.00D聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）透镜，直径11.00mm，内弧曲率9.00mm。将豚鼠随机分为5组（每组n=6）：A组（维生素C+全身荧光灯照射组，对照组），B组（维生素C+全身UVA照射组，对照组），C组（维生素C+核黄素+全身荧光灯照射组，对照组）。D组（维生素C+核黄素+全身UVA照射组，实验组），E组（核黄素+全身UVA照射组，实验组）。所有豚鼠均以基础日粮、100mg维生素C或0.4mg核黄素0.1%溶液灌胃，每日3次，从建立近视模型前3天开始至模型建立后2周。在建模期间，动物接受荧光灯照射（30厘米以上）或UVA照射（370±5nm）。在30厘米的距离下全身照射3 mW/cm。对于荧光灯照射，每次灌胃后开始照射，总日照射时间为8h；对于UVA照射，每次灌胃后开始照射，持续30分钟，总日照射时间为1.5h。每只动物的右眼为透镜诱导眼，对侧左眼作为对照眼。

 

屈光度和眼轴长度测量：大腿肌肉注射盐酸氯胺酮全麻后，用A型超声诊断仪测量其轴向长度。用视网膜检影验光法观察睫状肌麻痹前后的屈光度。

 

生物力学测量：2周后处死豚鼠，将眼放入保存液中，后用液氮低温保存，37～38℃水浴快速复温。应用微机控制生物材料测试仪对巩膜标本进行应力-应变试验。将15mm×4mm的巩膜条水平夹紧，应力水平为0.005～0.04N，应变以5mm/min的速度线性增加，以测试其抗拉强度，直至试样断裂。记录了极限荷载、极限应力和极限应变。

 

后巩膜厚度：摘除玻璃体、视网膜和周围结缔组织后，取自后巩膜的巩膜组织(直径6mm)立即浸泡在4%多聚甲醛中固定24小时，然后脱水，石蜡包埋，制成4μm的巩膜切片。4μm切片用苏木精-伊红染色和PAS染色。Zeiss光学显微镜用于测量不同放大倍数的标本（中央区域的巩膜组织厚度）。

 

免疫印迹：以3mm×4mm后巩膜组织（100mg）切片，用0.5～1mL冷溶缓冲液制备组织匀浆，然后在4℃和10000rpm下离心5min。以牛血清白蛋白（BSA）为标准，用BrdFrad法测定蛋白浓度。然后用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），用10%聚丙烯酰胺凝胶电泳和5%层凝胶电泳分离蛋白质溶液。将分离出的蛋白转移到硝酸纤维素膜上，然后用0.1%Tween-20(TBS-T)在Tris缓冲盐水中洗涤，然后用稀释的基质金属蛋白酶-2(MMP-2)抗体BA0569或MMP-2(TIMP-2)组织抑制剂BA0576在4°C下同膜封闭10～12小时。然后将膜在TBS-T中洗涤三次，在26℃与二抗一起孵育1小时，之后在TBS-T中再洗涤三次。后曝光。测定MMP-2、TIMP-2和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)条带的初级密度。

 

透射电镜术：用墨水笔在颞部角膜缘上做一个小标记，允许眼球摘除后定位。眼睛浸泡在0.05 M -二甲胂酸钠和2.5%戊二醛与磷酸盐缓冲盐水（pH 7.4）2小时。后进行角膜和晶状体解剖，在角膜缘区域留下痕迹。然后用角膜环钻（直径6毫米）打孔后组织。两个2毫米×1毫米的巩膜组织条从鼻腔附近的组织切除，从视神经上切除1mm。将该条带浸入0.05 M二甲胂酸钠和2.5%戊二醛24 h。组织标本经1%四氧化锇磷酸盐缓冲盐水(pH 7.4)固定1h,温度4℃,用1%醋酸铀酰双蒸馏水染色2h,然后用梯度丙酮冲洗脱水后包埋于Araldite中。使用透射电子显微镜分析巩膜样本。

 

结果：近视模型的建立：两周后，比较眼轴长度和屈光度的预测试参数和后测试参数。结果表明，晶状体诱发眼的眼轴长度和近视屈光度均显著长于前测眼轴，表明所建立的近视模型是成功的。对照组（A、B、C）在近视模型建立前晶状体诱发眼的平均轴长分别为7.37±0.25mm（A）、7.23±0.19mm（B）和7.27±0.24mm（C），14天后分别为8.31±0.09mm、8.25±0.11mm和8.11±0.17mm。实验组(D,E)口服核黄素和全身UVA照射后,晶状体诱发眼轴平均长度分别为:第0天7.09±0.18mm(D)和7.19±0.11mm(E),14天后分别为:7.94±0.10mm和7.99±0.09mm(E)。轴向长度的测量显示实验组（D，E）的近视眼净增量低于对照组（A，B，C）的近视眼。在本研究中，对照组和实验组之间有显著性差异。实验组（D，E）中近视眼的净增加较小，结果表明，我们的干预方法可以抑制近视的发展。

 

后巩膜厚度与生物力学测量：实验组（D，E）近视眼后巩膜平均厚度比对照组明显降低。虽然各实验组（D、E）间无明显差异，但结果显示口服核黄素全身UVA照射可使近视眼巩膜增厚。与对照组相比，各组近视眼的极限负荷和应力评定均较低，应变评定较高。实验组近视眼的极限负荷和应力评定显著高于对照组，近视眼的应变评定显著低于对照组。结果表明，在近视模型建立14天后，实验组（D，E）的近视眼极限负荷值高于对照组（A，B，C）。实验组D近视眼在近视模型制作14天后，其应力评定值明显高于对照组（A、B）。在近视模型制作14天后，实验组（D，E）的近视眼应变评估值低于对照组（A，B）。这些结果表明高度近视眼巩膜比正视眼更柔韧，其承载能力较低，但口服核黄素全身UVA照射可增加近视眼巩膜的生物力学特性。

 

基质金属蛋白酶-2和组织TIMP-2蛋白表达水平的研究：MMP-2和TIMP-2在近视的发生发展中起重要作用。视觉信号可以调节所选MMP和TIMP的基因表达，以控制巩膜重塑、巩膜的力学性质、轴向伸长和屈光状态。认为MMP-2的表达增加和TIMP-2的表达降低可促进近视的发生。证明全身UVA照射加口服核黄素可调节MMP-2和TIMP-2的表达。在对照组(A、B、C)中，近视组MMP-2表达显著升高，TIMP-2表达显著降低。而实验组（D，E），近视治疗不显著增加MMP-2的表达，也不显著降低TIMP-2的表达。但实际上增加了TIMP-2的表达。总之，我们的结果显示全身UVA照射加口服核黄素可以抑制近视的进展。

 

巩膜组织的透射电镜观察：透射电镜观察治疗后14天巩膜组织成纤维细胞增生情况。与对照组（A、B、C）相比，实验组（D、E）近视眼巩膜成纤维细胞密度明显增加，D、E组有更多的成纤维细胞出现。全身UVA照射加口服核黄素可增强巩膜组织成纤维细胞的增生。

 

结论：我们首次在豚鼠近视模型中，采用无创口服核黄素联合全身UVA照射降低近视眼轴向长度延长和限制近视屈光度增加。上述联合干预导致近视模型中MMP-2和TIMP（与巩膜重塑有关）蛋白水平和巩膜生物力学刚性的显著变化。发现C组与实验组（D，E）在轴向长度、应力评估和应变评估方面没有显著差异。一些波长的光可能具有类似于UVA（370±5nm）的作用，通过口服核黄素延缓近视的发展。需要进一步的系统研究以确定潜在的机制，解决潜在的毒性（如视网膜损伤），并开发保护性方案（如视网膜保护）。