如何确定您定制的是基因型正确的鼠？

​一般情况下，咱们拿到的定制基因编辑大/小鼠均附带有该鼠的鉴定报告，(PS: 没有的话，严重怀疑是否是正规机构哦！)在这些鉴定报告中哪些检测事项尤其需要咱们关注呢？基因编辑大/小鼠检测标准都有哪些？什么是基因编辑大/小鼠检测的金标准？为什么？为您一一道来

首先：确保打靶策略和试验方法正确无误

其次：收到鼠和鉴定报告后，除观察鼠的健康状态外，需特别注意质控标准！

基因编辑大/小鼠       三重检测标准

核型检测、PCR检测、Southern Blot检测

核型检测(ES细胞打靶)

取阳性克隆的细胞，分析细胞的核型。目的是防止染色体异常使小鼠出现异常表型。

PCR检测

利用目标片段上、下游引物，扩增出特定位置条带的反应。验证目的片段是否正确整合到对应的基因组中。

Southern 检测

进行基因组DNA特定序列定位的方法，其操作过程是利用电泳分离经酶消化后的DNA片段，然后在将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的DIG标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量。Southern杂交目的是检测目的基因的插入位置及拷贝数量。

如果经过这三项检测，均获得阳性结果，基本就可以确认得到的基因编辑大/小鼠基因型是没有问题的。

Southern Blot是基因编辑大/小鼠检测的金标准！为什么呢？

在制备基因敲进和条件性基因敲除模式小鼠过程中，可能会出现DNA连串插入^[1]，或者断裂随机插入^[2]的情况，Southern Blot 检测是非常重要的一步！

图1.小鼠基因组中整合的转基因及用Southern Blot进行基因型鉴定。（A）5个转基因副本头尾连串插入 （B）Southern Blot检测转基因小鼠的基因型分析。Naoto Haruyama, Andrew Cho,Ashok B Kulkarni. Curr Protoc Cell Biol. 2009; CHAPTER: Unit–19.10.

图2. （a）靶载体包含在外显子X基因处插入的新霉素抗性基因和末端的HSV-tk基因，靶载体和同源臂染色体基因的同源重组插入了neo^r抗性基因，破坏了X基因，发生同源重组后的载体不带HSV-tk基因。（b）最常见的是，靶载体会通过非同源重组随机的整合到宿主细胞基因组中，因为非同源重组插入外源DNA主要是通过线性化的靶载体末端发生的，HSV-tk和neo基因会一起整合入宿主基因组中。可以通过抗性筛选得到目的细胞。Mario R. Capecchi.Nat Rev Genet. 2005. 6(6):507-12.

划重点啦！

依据我们大量的数据统计分析发现，采用ES细胞方式制备，随机插入的概率约20%；采用CRISPR/Cas9技术，随机插入的概率约32%。而这32%中有14%的随机插入是无法靠交配传代去除的。通过Southern blot检测可以排除这种现象。做模式动物的朋友们，一定要让您的服务商做Southern blot检测哦，否则您投入的大量时间和金钱可能会化为乌有！

百奥赛图

百奥赛图无论是基于胚胎干细胞的基因编辑技术（ESC/HR），还是基于CRISPR/Cas9的EGE® 技术都始终坚持进行Southern Blot检测，您都可以放心用于科学研究!

参考文献

[1] Naoto Haruyama, Andrew Cho,Ashok B Kulkarni. Overview: Engineering transgenic constructs and mice. Curr Protoc Cell Biol. 2009; CHAPTER: Unit–19.10.

[2] Mario R. Capecchi.Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century. Nat Rev Genet. 2005. 6(6):507-12.