摘要：骺生长板发育不良(软骨发育不良)可被认为是临床前抗血管生成治疗的病理特征，它能在啮齿动物和猴中通过血管内皮生长因子受体（VEGFR）抑制剂，成纤维细胞生长因子（FGF）受体抑制剂，基质金属蛋白酶抑制剂，血管靶向剂被可靠和剂量反应性诱导。本文报告用口服脾酪氨酸激酶抑制剂治疗幼兔骨骺生长板发育不良，该抑制剂由VEGF和FGF家族激酶受体的非靶标抗血管生成抑制所诱导。骨骺生长板发育不良导致10只雄性动物中6只和10只雌性动物股骨头骨质变弱和骨折，1只雄性动物股骨远端关节软骨微骨折和不典型增生。骨折线穿过肥大软骨区（以及邻近区），与股骨头平行，常与股骨头移位有关。我们认为，生长板骨折在兔子中的高发病率已经为接受抗血管生成治疗的儿童提示可能产生的潜在额外的不良风险。

 

 

简介：生长板发育不良的机制是通过抑制生长板肥大软骨终末区的软骨内骨化，这是在软骨细胞转化成骨之前发出细胞凋亡信号的必要先决条件。发展性血管生成是病理性血管生成。在这种情况下，血管生成作为炎症、伤口愈合的驱动力，对癌症的发展至关重要。在后发性疾病中，血管生成与预后不良直接相关。因此，血管生成已成为药物治疗的一个有吸引力的靶点并不令人惊讶。在对这些药物和其他VEGFR抑制剂进行安全性评价试验期间，出现了许多具有临床前和临床意义的血管生成依赖性毒性。这些毒性的特征是靶器官的血管功能不全，如生长的骨和啮齿动物切牙，需要持续的血管生成以支持生长。在其他器官，如肾上腺和脉络丛，血管内皮生长因子信号是维持血管内皮所必需的。因此，在啮齿动物中，用VEGFR抑制剂治疗可导致一系列的毒性，其特点是切牙发育不良、卵巢萎缩、剂量反应性骺板发育不良、肾上腺变性、脉络丛炎症以及其他一些特征不太好的变化。在骨骼中，VEGF将软骨生成与成骨结合。VEGF抑制导致骺板增厚，这是由于肥大软骨细胞滞留在软骨-骨交界处的骺肥大软骨的终末区。其机制是通过血管内皮生长抑制导致的血管延迟侵，而血管内皮生长因子抑制是在软骨细胞转化成骨骼之前发出细胞凋亡信号所必需的过程。在用贝伐单抗和成纤维细胞生长因子受体（FGFR）抑制剂以及基质金属蛋白酶（MMP）- 9抑制剂治疗的猴子和大鼠中已经观察到相同的变化。FGF是调节内皮细胞生长、迁移和存活的有效血管生成分子，而MMP-9是生长板血管生成和肥大软骨细胞凋亡的关键调节因子。骺板生长板发育不良可被认为是继发于生长动物抗血管生成的靶相关毒性。本文报告幼兔骨骺生长板发育不良和骨折，用脾酪氨酸激酶（SYK）抑制剂福斯马替尼二钠治疗。这种作用由活性代谢物R406介导，R406抑制VEGF和FGF家族激酶受体，其效力与预期的SYK治疗目标相似。兔生长板中观察到的发育异常变化与用VEGFR和FGFR抑制剂治疗的其他物种中观察到的形态学变化相同。据作者所知，这是家兔骨骺生长板发育不良的第一份报告，也是临床前物种中由发育不良导致的第一例骨骺骨折，说明这种变化在较大物种中的潜在不利影响。

 

动物及处理：新西兰兔，单笼饲养，笼中有咀嚼块、纸板管和筑巢材料，自由采食和饮水。温度和相对湿度分别为16°C-20°C和40-70%，维持12小时的光/暗循环。动物在第一次服药前至少适应7天，给药开始时9周龄。9周龄的动物包括41只雄性动物和39只雌性动物（分为对照、低、中、高剂量，每组20只动物），每天两次口服0、5、15或30mg/kg灌胃，持续28天。所有动物每天至少观察一次临床体征，每天两次测量体重，并与预定值进行比较。在研究的第一天和最后一天，取0.3ml的血样进行毒物动力学取样，以测定活性代谢物R406。第25天（雄性）或第27天（雌性）从耳缘静脉取血约1.5ml，用于临床病理学评价。

 

临床病理学：血液样品分析红细胞和白细胞指数以及血液生化指标(白蛋白、丙氨酸氨基转移酶[ALT]、碱性磷酸酶[ALP]、天冬氨酸氨基转移酶、胆红素、钙、胆固醇、肌酐、球蛋白、葡萄糖、谷氨酸脱氢酶、磷酸盐、钾、钠、总蛋白、甘油三酯和尿素)。使用配对Shirley检验对测量指标的变化进行统计学意义分析。

 

尸检与组织学：所有动物都被静脉注射过量的戊巴比妥钠处死。动物根据标准操作规程进行解剖，记录宏观异常。取材包括血管生成依赖性组织(股骨头、股骨胫关节、胸骨、肾上腺、切牙的下颌骨和卵巢)、造血组织(胸腺和脾)以及胃肠道、心脏、肾脏、肝脏、气管和肺。对肾上腺、肝脏、卵巢、脾脏和胸腺进行修整和称重。使用数据统计软件包分析器官重量的变化是否具有统计学意义。取材组织浸泡在缓冲的10%福尔马林中，加工成蜡块，然后切片，用H&E染色，根据标准操作原理进行光镜检查。骨固定2-3天，然后转移到10%甲酸中脱钙，直到骨头有轻微的弯曲（通常1-2周）。骨切片4um厚，将切片在37℃下在培养箱中过夜干燥，在60℃烘箱中加热10分钟，然后脱蜡，在染色前水合。

 

结果：毒理动力学评价：毒物动力学评价证实，对照动物没有暴露，每天两次，剂量为15-30mg/kg的动物近似成比例暴露(Cmax和曲线下面积[AUC])。除了第28天的雌性动物外，不能确认每天两次剂量为5mg/kg的动物的暴露，因为样品低于较低的定量水平。30mg/kg/d雌雄动物游离Cmax和游离AUC分别为298nmol/L和269nmol/L和320万nM hr/L和25900nM hr/L。

 

临床症状：在第28天由于后腿跛行，一只动物出于福利原因被安乐死。所有剂量水平均耐受良好。每天两次剂量为30mg/kg的雄性动物体重增加减少（与25天至29天之间的对照值相比，大约26%）。每天两次15和30mg/kg福斯马替尼给药的雄性和雌性动物，，红细胞分布宽度略高（6-22%）。每天两次给予30mg/kg的雄性和雌性动物白细胞计数较低（24-44%），而每天两次给予15和30mg/kg的雄性动物血小板计数稍高（31-43%）。对雄性和雌性动物每天两次注射530mg/kg也导致肝指数(ALP、总胆红素)轻度升高，对雄性和雌性动物每天两次注射30mg/kg则导致ALT轻度升高。

 

病理：尸检时唯一显著的宏观变化是1只雄性动物每天两次用30mg/kg给药的左股骨头和右股骨头双侧骨折，一只雄性动物每天两次用30mg/kg给药的右股骨头单侧骨折。15和30mg/kg每日两次处理的雄性动物脾脏重量显著降低，30mg/kg每日两次处理的雌性动物脾脏重量显著降低，30mg/kg/日处理的雄性动物脾脏重量显著降低，15和30mg/kg每日两次处理的雌性动物脾脏重量显著降低。此外，每日5～30毫克/公斤雌性动物的肾上腺重量显著增加。胸腺、脾脏和肾上腺器官重量的变化与任何微观变化无关。在显微镜下，观察到许多剂量反应和化合物相关的变化，其中最显著的是骺生长板发育不良和生长板（骺）骨折。与雌性动物相比，雄性动物生长板发育不良和股骨干骨折的发生率更高，而股骨头则更严重。在胸骨中，骨或生长板没有变化。生长板异常增生的特征是肥大软骨细胞滞留导致肥大软骨终末区弥漫性增厚和扩张。在15和30mg/kg每天两次雄性和雌性动物股骨头，生长板发育不良轻微至明显。1只雄性动物的肥厚软骨生长板区的水平微骨折。另外30mg/kg每日两次给药的5只雄性（其中一只是双侧的）和1只雌性动物生长板全层断裂。生长板骨折时常伴有出血、基质变性(嗜碱性染色消失)、软骨细胞坏死、股骨头移位，这是由于在肥大软骨区域内或在肥大软骨区域与邻近区域之间的界面处分离造成。1只雄性动物经30mg/kg每日两次治疗后，股骨远端关节软骨肥厚区与成熟区交界处出现轻度变性和微骨折。在股骨胫骨关节，用15和30mg/kg每天两次治疗的动物有轻微到中度的骨骺生长板发育不良，但这并不伴有骨骺骨折。用15和30mg/kg每天两次处理的动物股骨头、股骨关节和胸骨骨髓细胞少量至中度减少。用5-30mg/kg每天两次处理的动物的卵巢中，退化/坏死的卵泡少量至轻微增加。

 

结论：兔生长板比小鼠或大鼠更精确地模拟儿童抗血管生成治疗的潜在副作用。用有效的抗血管生成分子治疗儿童可能与生长板骨折和可能的关节软骨微骨折的额外不良风险相关。