摘要：背景：脊髓由大量细胞组成，这些细胞相互作用，使有机体发挥功能。要对脊髓损伤（SCI）中涉及的细胞过程进行详细研究，必须使用可重复和特定的方法来定位和损伤脊髓的限制区域。

 

方法：提出了一种激光诱导斑马鱼脊髓损伤的方法。利用配备飞秒近红外泵浦激光器的双光子显微镜，探讨了激光束暴露时间、面积和强度对周围细胞的精确和可重复的脊髓损伤的影响。

 

结果：通过对斑马鱼幼体的行为研究，我们评估了强激光照射脊髓的功能结果。我们的实验表明，波长为800 nm、持续时间为2.6 ms、光强为390 mW的激光脉冲足以诱导单细胞或脊髓节段的受控细胞死亡。如果细胞暴露在超过470 mW的激光脉冲下，则观察到附带损伤。在这些条件下，我们可以诱导斑马鱼幼虫精确和可重复的脊髓损伤，导致运动和感觉功能丧失。本方法为斑马鱼的脊髓损伤诱导提供了一种简单、可控的方法。我们描述了如何调整近红外飞秒激光器以获得最佳结果，同时尽量减少附带损伤。

 

结论：本文提出了一种利用飞秒近红外激光脉冲，以单细胞分辨率诱导斑马鱼脊髓损伤的方法。

 

 

简介：脊髓损伤（sci）是一种通常涉及大量细胞损伤并导致周围组织细胞死亡和炎症的状态。脊髓损伤通常是由交通事故、潜水或坠落造成的脊髓损伤引起的。这种创伤直接或间接影响许多不同的细胞类型，如神经元、胶质细胞、平滑肌细胞和免疫细胞，以及结缔组织和血管系统。SCI可分为两个不同的阶段：第一阶段包括对组织的物理损伤，第二阶段包括几个过程，如肿胀、疤痕形成、兴奋性毒性、免疫介导毒性和活性氧物质的产生。目前还很少有研究工具能够在具有精确空间定位和高重复性的活生物体中诱导SCI。目前对SCI的认识和由此引起的细胞损伤仍然非常有限，因此，在治疗SCI患者方面需要更好的研究工具。近红外飞秒激光脉冲可作为显微手术的有力工具，专门针对细胞器、单细胞或组织。这项技术已被用于许多目的，包括线粒体的亚细胞分离、微管和光转染。使用飞秒激光诱导空间精确细胞死亡的关键优势在于，这种激光利用近红外（800 nm）光工作，由于低光散射和吸收，近红外（800 nm）光能深入穿透组织。此外，在相同超短脉冲持续时间（140 fs）下，亚细胞显微解剖的激光强度比慢速激光或紫外线激光显微剪刀所需的要低，后者需要2到3个数量级的高激光强度才能造成相同的损伤。然而，为了在不造成附带损伤的情况下实现高重复性和特定靶向细胞死亡，必须严格控制激光照射的设置。斑马鱼是研究活动物细胞机制的优秀模型系统。现有的转基因菌株种类繁多，能够很容易地跟踪和操纵细胞和分子机制。斑马鱼的另一个优点是，它在发育过程中是光学透明的，可以通过化学处理保持透明。变异的动物其成年后也能保持透明度。斑马鱼的行为能力可以用来评估基本（如自发运动、反射）和复杂（如社交、学习和记忆、恐惧和攻击）的行为，因为它们在斑马鱼身上有很好的特征。此外，与啮齿动物相比，斑马鱼的饲养成本更低。值得注意的是，斑马鱼具有中枢神经系统（CNS）再生的内在能力，并且在脊髓损伤后恢复运动功能。并且已经用斑马鱼幼虫对不同的SCI损伤方法进行了评估，包括玻璃毛细管、金属针或激光损伤。

 

方法：成像：使用配备蔡司Zen软件的双光子（2P）激光扫描显微镜、物镜（40倍）和变色龙超II钛宝石可调谐近红外激光器进行活体斑马鱼和细胞记录。我们使用20×和512×512像素进行所有细胞死亡和脊髓损伤实验。用共聚焦显微镜记录不同干涉对比图像。对于所有使用活细胞的实验，温度都同灌注室一致。采用IMAGEJ v1.44P和IMARIS进行图像后处理。

 

功率剖面测量：使用配备热电堆传感器的光功率计对光强度进行评估。采用连续单向扫描、变焦因子1.0、分辨率512×512像素、像素停留时间25.61μs测量光强。在安装或不安装物镜的情况下进行测量，以避免光学影响。

 

动物：斑马鱼饲养温度为28摄氏度，光照14小时，暗照10小时。根据既定程序，从自然产卵中采集胚胎，并在无光照的培养箱中培养。使用以下斑马鱼系：Tg（Tol-056）、Tg（Gfap:Gfp）和野生型（AB）。使用受精后24-144小时（hpf）的斑马鱼。实验前用0.02%（w/v）MS-222在E3水中深度麻醉动物，然后用1%低熔点琼脂糖固定。通过轻轻触碰鳍的尾端来验证麻醉效果。当实验超过20分钟时，用MS-222溶液灌注成像室。

 

细胞系：使用传代5-20次的Hela细胞，并进行培养。细胞在含有10%FBS和1%Pen-Strep和酚红的DMEM中单层培养，融合率为80%。然后在Krebs缓冲液中进行实验，配方NaCl 119.0mM、KCl 2.5mM、NaH2PO4 1.0mM、CaCl2·2H2O  2.5mM、MgCl2·6H2O 1.3mM、Hepes 20.0mM、D-葡萄糖（葡萄糖）C6H12O6 11.0mM，pH调整至 7.4。

 

脊髓损伤:用0.02%MS-222在E3水中麻醉斑马鱼，然后在35 mm培养皿中装入1%的低熔点琼脂糖。对于激光诱导的SCI，将含有斑马鱼的琼脂糖培养皿安装在2P显微镜上进行SCI实验。SCI诱导后，将斑马鱼从琼脂糖中取出，用新鲜E3水冲洗1分钟。将鱼置于24孔板中，加入新鲜的E3水，在设定为28.5摄氏度的培养箱中恢复2h，并在进一步测试前打开灯。采用0.02%MS-222在E3水中对针刺致脊髓损伤的斑马鱼幼虫（4 DPF）进行麻醉。然后将幼虫放在培养皿的盖子上，吸取多余的水。用30 G锋利的注射器针在第10节脊髓水平处切断脊髓。斑马鱼幼虫激光诱导脊髓损伤的持续时间如下（时间取决于技能，因此近似值如下所示）：斑马鱼幼虫麻醉并贴上琼脂糖（3分钟/动物）。治疗前记录Z叠勾勒脊髓轮廓（2 min/只）。激光照射（3 min/动物）可诱发脊髓损伤。治疗后记录Z叠，以验证病变（1 min/动物）。从琼脂糖中释放斑马鱼幼虫（2分钟/动物）。所有对斑马鱼幼虫激光诱导脊髓损伤的程序，每只动物大约需要11分钟。

 

斑马鱼运动行为：斑马鱼的运动功能测试是在一个环境光控制和声音刺激定制的行为实验装置中进行的。整个记录过程中，记录室的温度保持在28.5摄氏度。斑马鱼的幼虫分别在24孔板上，在开始行为测试前至少适应10 min。ethovision?XT 10（noldus）软件用于以每秒50帧（fps）的速度对游泳活动进行视频跟踪，并控制声音刺激和光。在恒定的背景红外照明下，以50 fps的速度记录游泳活动。感觉评估是通过手动应用钨针针刺斑马鱼。行为数据显示为3分钟内的总游泳距离（mm）和平均速度（mm/s）。

 

细胞死亡：当检测到细胞出血、核固缩和/或细胞膜破裂时，或根据制造商的说明，通过FAM-FLICA分析测量酶caspase-3/7的活性来确定细胞死亡。简言之，FLICA进入细胞并与活性caspases-3/7不可逆结合。37度下,细胞在FLICA中孵育1小时，在细胞凋亡洗涤缓冲液中洗涤3次（包括在试验中），然后用PI和Hoechst标记细胞。然后用共聚焦显微镜对细胞成像，488 nm激发，515–550 nm检测。

 

细胞内Ca2+成像：用Ca2+指示剂Fluo-4/AM（5μM）检测细胞溶质Ca2+水平。细胞在37摄氏度的DMEM中孵育20分钟，然后在Krebs溶液中洗涤两次。在Krebs溶液中使用热控灌注室进行实验。在488 nm下以1–2 Hz的采样频率进行激发，在500–550 nm处检测到排放物。

 

斑马鱼胚胎的荧光染色：将斑马鱼胚胎固定在4%多聚甲醛PBS中，室温下，在含有0.5%Triton X-100（PBS-T）的PBS中洗涤3次，持续30 min。在含有0.1%Triton X-100、5%Ngs和1%BSA的溶液中，在室温下进行2 h的阻断，均在PBS-T中稀释。为了观察F-肌动蛋白，将胚胎与Texasred-X（1:200）在4°C的封闭溶液中孵育过夜。成像前，将胚胎在PBS-T中洗涤2 h，装入4%的低熔点琼脂糖中，并以200μm的厚度切片。用共聚焦显微镜记录图像。

 

微注射与GFP表达检测:含Tol2转座子序列的载体pmini（zK5p-EGFP）（80μg/ml）在1-4细胞期与Tol2-mRNa（4μg/ml）共注入胚胎。24 hpf胚胎去蛋白，麻醉（0.02%MS-222），并将其固定在1%低熔点琼脂糖上的盖玻片上，用于成像和单细胞消融。

 

结果：激光曝光参数：在配备可调谐近红外飞秒激光的2P显微镜下，我们试图建立一种精确、可靠的斑马鱼幼虫SCI诱导方法。首先，我们绘制了波长从700 nm到900 nm的光强图，在输出功率为50%和100%时，阶跃为10 nm。使用连接到功率计的热电堆传感器以瓦特为单位测量光强度。在50%和100%输出功率下，检测到最高峰值约为800 nm。然后我们评估了800 nm处的光强度和输出功率之间的相关性。我们观察到有或没有安装物镜的线性相关性。接下来，进入培养的Hela细胞，观察激光诱导的细胞死亡。当我们观察到细胞的形态学变化，如细胞出血、质膜破裂、核固缩、DNA碎裂或半胱天冬酶-3/7的分裂时，确认一个细胞死亡。我们将可调谐近红外飞秒激光器调整到800 nm和30%的输出功率（230 mW），将单个Hela细胞暴露在光下。我们将像素停留时间（每个像素的曝光时间）设置为25.61μs，将曝光面积设置为10×10像素（约为单元大小的1/10）。10×10像素区域的总持续时间为2.6 ms。使用这些设置，我们没有观察到目标细胞的任何可见形态变化。然后，我们将输出功率增加到50%（390 mW），同时保持其他参数不变。在这种情况下，我们观察了暴露细胞的形态变化。当输出功率调整到80%（630 mW）时，我们开始观察对邻近细胞的影响，如细胞出血。为了进一步评估邻近细胞的死亡和附带损伤，我们研究了DNA片段和裂解半胱天冬酶-3/7。使用800 nm/230 mw/2.6 ms，我们无法检测到任何细胞死亡。然后，我们再次将输出功率增加到50%（390 mW），同时保持其他参数不变。在暴露的细胞中观察到DNA片段和裂解的caspase-3/7。此后，我们通过使用波长800 nm和持续时间2.6 ms在0–100%（0–810 mW）之间调整输出功率进行了定量分析。. 通过这一分析，我们可以确定，40-60%（310-470 mW）之间的功率几乎在所有靶向细胞中诱导细胞死亡，而几乎没有任何邻近细胞被杀死。为了评估激光照射下细胞的功能，我们随后测量了hela细胞中的细胞溶质钙（Ca2+）流量。细胞加载Ca2+敏感探针Fluo-4/AM。并在荧光显微镜下检查。将一个单细胞暴露于800 nm/390 mw/2.6 ms下会在暴露的细胞中触发强Ca2+瞬变，并在邻近细胞中引发轻微的流入。.当输出功率增加到80%（630 mW）时，邻近细胞也表现出明显的Ca2+波动。这些结果表明，在单个细胞中可以诱导细胞死亡，同时对邻近细胞造成最小的损伤。

 

附带损害：我们使用800 nm和50%输出功率（390 mW）研究了暴露区域和位置对目标细胞和相邻细胞的影响。我们决定使用10×10像素的标准曝光面积和2×2像素的较小曝光面积。暴露面积为10×10像素时，我们检测到所有目标细胞中的细胞死亡，而较小面积为2×2像素时，10%的目标细胞死亡。两个暴露区域中的任何一个都没有杀死邻近的细胞。然而，当我们将整个细胞暴露在激光下时，60%的实验中观察到了附带损伤。我们使用800 nm/390 mw/2.6 ms/10 x 10像素测试了曝光区域的不同空间位置。当暴露在细胞核或胞质溶胶中时，我们观察到几乎所有细胞种类中的细胞死亡。为了测试胞质溶胶中的不同位置，我们以细胞的中心或质膜为目标。当暴露细胞中心时，我们没有观察到附带损伤，而暴露质膜时，我们在20%的实验中检测到附带损伤。激光束的聚焦对细胞死亡也有影响，光线偏离焦点只杀死40%的目标细胞。我们还缩短了持续时间，观察到0.3 ms时没有细胞死亡。通过这些结果，我们发现在细胞质中心用800 nm/390 mW/2.6 ms聚焦激光可诱导特异性细胞死亡。

 

斑马鱼幼虫脊髓损伤的研究：我们试图在斑马鱼幼虫中测试我们的方法。我们使用我们以前的特征参数800 nm/390–450_mw/2.6ms/10x10像素，以下简称为斑马鱼脊髓损伤（zscl）设置。为了验证我们的参数在活体动物中起作用，我们首先在斑马鱼幼虫24 hpf的1-4细胞阶段用pminitol2（zk5p-egfp）和tol2转座酶RNA的混合物注射胚胎，以确定其皮肤细胞的靶向。这些结构在角质化上皮细胞中诱导了短暂的EGFP镶嵌表达，我们可以用荧光显微镜观察治疗效果。用激光照射斑马鱼24 hpf的单个皮肤细胞，我们的zscl设置触发目标细胞的细胞死亡，而相邻细胞保持完整和功能。单个皮肤细胞的缺失激活了周围细胞的收缩并形成了一个F-肌动蛋白环，这表明邻近细胞仍保持功能。接下来，我们要探讨在4 dpf斑马鱼幼虫中诱导脊髓损伤的可能性。之所以选择这个年龄，是因为脊髓的器官发生已经完成，并且可以评估强健的行为读数。由于脊髓损伤通常涉及到脊髓中更大区域的损伤，因此我们针对的是整个节段。为了使脊髓可视化，我们使用了一种在星形胶质细胞中表达gfp的转基因斑马鱼线。用MS-222麻醉动物，用琼脂糖固定在培养皿中。将培养皿安装在2P显微镜的台上，并在背面成像。. 为了勾勒出暴露区域的轮廓，我们首先记录了脊髓的Z叠。在显微镜软件中设置曝光面积，用zscl设置诱导脊髓损伤。由于脊髓是三维的，所以我们必须在脊髓的整个第10节应用暴露量来造成损伤。这是通过6μm的增量步骤完成的。通过观察激光照射后的脊髓来检查这种治疗的效果。靶区没有GFP信号表明细胞受损。激光手术后，将斑马鱼从琼脂糖中取出，在28.5摄氏度的新鲜E3水中恢复2小时。然后，将动物移入行为设置中的单个孔中，在打开灯的情况下适应至少10分钟。当实验开始时，我们将灯保持打开两分钟，然后关闭三分钟。关闭灯会诱导斑马鱼的游泳行为。我们分析了游泳距离和速度。与假手术组相比，脊髓损伤动物的游泳距离和游泳速度明显受损。众所周知，斑马鱼具有中枢神经系统再生的内在能力，并且在脊髓损伤后恢复运动功能。为了验证我们的方法不会导致严重的副作用影响再生，我们评估了激光诱导脊髓损伤后的功能恢复。我们发现，与假动物相比，接受激光诱导脊髓损伤的动物在24 hpl时游泳距离和平均速度受损。然而，在48 hpl时，治疗动物的运动功能完全恢复。当我们比较斑马鱼与激光或针所致脊髓损伤的游泳距离和平均速度的恢复时，我们只观察到细微的差异。为了进一步挑战我们的方法，我们下一步要瞄准更精确的脊髓区域。斑马鱼有毛细胞，毛细胞是一种特殊的神经元，胞体位于脑干，轴突横跨整个脊髓。斑马鱼有两个这样的细胞，使它们非常适合于诱发脊髓的部分损伤。两个毛细胞整合了所有的感觉方式，同步激活脊髓另一侧的运动神经元，同时抑制同侧毛细胞。这导致肌肉同时单侧收缩，转化为C-启动反射。在转基因Tol-056:GFP动物中用GFP标记毛细胞。我们通过测量声音刺激下移动的距离来分析惊吓反应。在SCI动物中，我们仍然可以检测到对声音刺激的反应，但幅度明显降低。此外，在脊髓损伤动物中，典型的C-启动逃逸反射消失。定量分析显示，与假动物相比，SCI动物每回合的游泳距离显著减少。我们还以脊髓的特定亚区域为目标，以评估在体内可能的附带损伤。我们在gfap:gfp 4 dpf斑马鱼第10节的右侧用zscl设置引导激光，观察到激光手术后左半部分没有受到影响。然后，我们进行了运动研究，以研究这些动物的游泳行为。我们发现用激光治疗右半脊髓的动物大部分表现为单侧游动轨迹。与预期的一样，受损的幼虫表现出明显的游动轨迹改变，自发性转向主要是对侧病变。

 

结论：这些结果表明飞秒近红外激光脉冲可以实现特定的单细胞死亡。通过控制光照参数，可以实现斑马鱼幼虫的特异性脊髓损伤。这种方法提供了一个对脊髓靶区和细胞的侧枝损伤最小的精确和可重复的方法。