在与病毒或癌症的长期对抗中，精疲力竭的T细胞会逐渐丧失功能，这种状态被称为T细胞耗竭。在当今大热的免疫治疗中，检查点阻断会促进肿瘤浸润CD8+ T淋巴细胞的增殖。不过，这种现象背后的机理仍不清楚。

瑞士洛桑大学Werner Held领导的研究团队近日鉴定出肿瘤内Tcf1+PD-1+CD8+ T细胞，这些细胞表现出干细胞样特征，并响应治疗性疫苗接种和免疫检查点阻断免疫疗法，促进肿瘤控制。

这篇题为“Intratumoral Tcf1+PD-1+CD8+ T Cells with Stem-like Properties Promote Tumor Control in Response to Vaccination and Checkpoint Blockade Immunotherapy”的文章于1月15日发表在《Immunity》杂志上。

检查点阻断介导了肿瘤浸润CD8+ T淋巴细胞（TIL）的增殖反应。这种反应的来源仍不清楚，因为慢性活化促进了T细胞的终末分化，也就是T细胞耗竭。研究人员此次鉴定出肿瘤反应性TIL的亚群，它们表现出耗竭细胞和中枢记忆细胞的标志，也就是表达检查点蛋白PD-1和转录因子Tcf1。

他们发现，Tcf1+PD-1+ TIL介导了免疫治疗时的增殖反应，产生了Tcf1+PD-1+细胞和分化的Tcf1−PD-1+细胞。Tcf1+PD-1+ TIL的消融限制了对免疫治疗的响应。Tcf1不是产生Tcf1+PD-1+ TIL所必需的，但对于维持这些细胞的干细胞样功能是必需的。

他们在黑色素瘤患者血液的肿瘤反应性CD8+ T细胞和原发性黑色素瘤的TIL中检测到人Tcf1+PD-1+细胞。因此，免疫检查点的阻断不依赖于T细胞耗竭程序的逆转，而是依赖于干细胞样TIL亚群的增殖。

背景

CD8+ T细胞在某些肿瘤中的浸润程度可以预测患者的总生存率，表明淋巴细胞可限制肿瘤生长。尽管如此，大多数浸润的肿瘤仍有进展，表明这种自发的抗肿瘤免疫反应通常不足以控制肿瘤。免疫治疗旨在增强抗肿瘤的免疫应答，以诱导持久的肿瘤控制。目前的方法包括过继性T细胞治疗以及抑制性受体（免疫检查点）的阻断。

在与病毒或肿瘤的长期对抗中，T细胞的功能会逐渐丧失（称为T细胞耗竭）。它们失去效应功能，并诱导T细胞功能的负向调节剂PD-1。通常这种耗竭的表型被认为是终末分化的细胞，它们丧失扩增能力，且寿命短暂。然而，阻断PD-1后肿瘤内CD8+ T细胞出现增殖，这与终末分化的概念存在矛盾。

为此，研究人员想了解自发或免疫治疗引起的抗肿瘤CD8+ T细胞反应是否涉及到记忆性CD8+ T细胞组分，如果是这样，这些细胞是否属于肿瘤微环境的一部分。

Tcf1的缺乏削弱了肿瘤控制

为了确定CD8+ T细胞对肿瘤的反应是否涉及到记忆成分，研究人员检测了这些反应是否依赖转录因子Tcf1，它对中枢记忆性CD8+ T细胞的形成和功能至关重要。他们将野生型WT或Tcf7-/- CD8+ T细胞过继转移到幼稚C57BL/6（B6）小鼠中。一天后，在这种P14嵌合体小鼠皮下植入表达LCMV gp33的B16黑色素瘤细胞。这种方法可用来追踪肿瘤特异性的CD8+ T细胞，并确定这些细胞及其亚群是否与肿瘤控制有关。

在肿瘤可触摸时，他们利用gp33肽来免疫小鼠。疫苗接种以及WT或Tcf7-/- P14细胞的组合导致肿瘤大约在一周后短暂消退。他们发现，与WT P14细胞相比，Tcf7-/- P14细胞的保护作用是短暂的。在治疗终点时，WT中肿瘤浸润CD8+ T淋巴细胞的丰度比Tcf7-/- P14高10倍。因此，缺乏Tcf7的P14 TIL在疫苗接种早期丰度高，但随后下降，这与肿瘤控制的减少存在关联。

肿瘤特异性TIL包含大量Tcf1+PD-1+ 和Tcf1-PD-1+ CD8+ T细胞

由于延长的肿瘤控制依赖于Tcf1，研究人员接着鉴定接种疫苗和未治疗的小鼠中WT P14细胞中Tcf1的表达。幼稚P14细胞表现为均匀的Tcf1+。类似地，当未治疗小鼠出现可触摸的肿瘤时，大部分P14 TIL为Tcf1+，但也表达PD-1。当肿瘤中等大小时，Tcf1+PD-1+ P14 TIL的丰度增加8倍，但当肿瘤增大至1 cm3时，其丰度下降。

他们为出现肿瘤的小鼠上接种治疗性疫苗，一周后，Tcf1+PD-1+ P14 TIL强烈扩增（176倍），并且这些细胞在终点时仍然以很高的数量存在。P14 TIL还包含相当量的Tcf1-PD-1+亚群，它们与Tcf1+PD-1+ TIL平行扩增和减少。通过GFP标记实验，他们还发现Tcf1+PD-1+ TIL组成型地存在于肿瘤中。随着肿瘤进展，它们的丰度瞬时增加，并且通过治疗性疫苗接种而进一步扩增。

Tcf1+CD8+ T细胞在肿瘤控制中的作用

为了评估肿瘤特异性Tcf1+CD8+ T细胞在免疫应答和肿瘤控制中的重要性，研究人员委托赛业生物（Cyagen）生成了一种小鼠品系，允许在体内选择性消融表达Tcf1的细胞。他们将白喉毒素受体（DTR）T2A GFP融合基因插入含有Tcf7基因座的BAC中，制备出Tcf7DTR-GFP转基因小鼠。接着，他们生成了Tcf7DTR-GFP P14嵌合体小鼠，并植入B16-gp33肿瘤细胞。白喉毒素（DT）处理能够有效去除GFP+ P14 TIL，但对GFP- P14 TIL的丰度无影响。

他们之后用DT处理荷瘤小鼠，并再次免疫接种。DT暴露使得表达GFP或Tcf1蛋白的P14细胞几乎消失，而Tcf1- P14细胞的丰度也降低。这表明Tcf1+细胞维持了Tcf1- TIL的产生。Tcf7DTR-GFP P14嵌合体小鼠在处死时肿瘤的体积和重量都较低。相比之下，当Tcf1+ P14细胞被消融时肿瘤出现进展。这些数据表明，肿瘤特异性Tcf1+PD-1+ CD8+ T细胞是形成抗肿瘤免疫力所必需的。

如此看来，治疗性疫苗的接种所带来的肿瘤控制依赖于肿瘤特异性Tcf1+PD-1+CD8+ T细胞的存在。之后，研究人员又通过一系列实验，证实了的确是瘤内细胞而不是外周细胞的贡献。

对免疫检查点阻断疗法的响应

在动物模型和癌症患者中，共抑制受体（如PD-1和CTLA-4）的阻断可以介导T细胞依赖的肿瘤消退。然而，这种治疗干预背后的分子机制仍不清楚。研究人员猜测，Tcf1+ CD8+ T细胞可能在免疫检查点阻断疗法中发挥作用。

他们使用了Tcf7DTR-GFP P14嵌合体小鼠，利用FTY720来防止新的T细胞流入肿瘤，并利用白喉毒素（DT）来消融Tcf1+ P14 TIL。与对照小鼠相比，检查点阻断疗法使Tcf1+和Tcf1- P14 TIL的丰度增加10倍以上。Tcf1+ TIL的消除则大大减少了Tcf1- P14 TIL的丰度。因此，检查点阻断扩增了肿瘤内Tcf1+ TIL，而这些细胞是产生分化的Tcf1- TIL所必需的。

肿瘤内Tcf1+PD-1+CD8+ T细胞具有干细胞和耗竭细胞的特征

考虑到Tcf1+PD-1+ TIL对于肿瘤控制的重要性，研究人员对这些细胞进行了分子鉴定。他们通过功能分析发现，Tcf7GFP+ TIL具有扩增、分化和再生Tcf7GFP+细胞的潜力。与这些干细胞样特征一致，RNA-seq分析也发现Tcf7GFP+ P14 TIL的转录本与成体干细胞或造血干细胞表达的部分基因显著重叠。同时，Tcf7GFP+ TIL也表达了多个耗竭标志物（Lag3、Pdcd1、CTLA4），而Tcf7GFP- TIL还选择性地表达了更多的耗竭相关基因，表明这些基因的表达与分化相关。

黑色素瘤患者中存在Tcf1+PD-1+CD8+ T细胞

之后，研究人员又对黑色素瘤患者的外周血CD8+ T细胞以及原发性黑色素瘤进行分析，的确检测到Tcf1+PD-1+CD8+细胞。单细胞RNA-seq数据表明，人黑色素瘤含有TCF7+PDCD1+CD8A+ TIL，其基因表达谱与小鼠模型中鉴定出的细胞相似。通过TCGA数据库的荟萃分析，他们认为TCF7/PDCD1特征与患者生存率的改善相关。

研究人员认为，这项研究揭示了共表达Tcf1和PD-1的肿瘤内CD8+ T细胞在免疫治疗中发挥关键作用。研究结果有助于人们了解免疫干预如何影响抗肿瘤的免疫应答。这些干细胞样细胞的鉴定有望进一步改善所有类型的癌症免疫治疗。

原文检索

Intratumoral Tcf1+PD-1+CD8+ T Cells with Stem-like Properties Promote Tumor Control in Response to Vaccination and Checkpoint Blockade Immunotherapy

DOI: https://doi.org/10.1016/j.immuni.2018.12.021