摘要：背景：缺血再灌注（I/R）是脑缺血所致认知功能障碍的重要病理生理基础。血红素氧合酶-1（HO-1）是通过与血凝酶结合（HPX）消除过量游离血红素的限速酶，HPX是一种血浆蛋白，有助于在缺血卒中期间消除过量游离血红素。本研究旨在阐明HPX是否能减轻脑I/R大鼠的认知功能障碍。

 

方法：将大鼠随机分为五组：假手术组、MCAO、赋形剂组、HPX和HPX+原卟啉IX（ZnPPIX）。MCAO诱导脑I/R。再灌注后立即在脑内注入生理盐水、赋形剂、HPX和HPX+ZnPPIX。采用Morris水迷宫（MWM）测试法检测学习和认知功能。采用免疫印迹法检测缺血半暗区组织中HO-1的表达。用CD31/vWF双标记免疫荧光法检测半暗区海马新生血管的形成。通过伊文斯蓝（EB）的通透性、脑组织含水量、Ang1/Ang2和VE-钙粘蛋白的表达，检测血脑屏障（BBB）的结构和功能。

 

结果：研究证实，HPX提高了学习和记忆能力。血栓素上调HO-1蛋白表达、半暗区海马平均血管密度和VE-钙粘蛋白表达，但降低了脑组织的通透性、脑组织含水量和Ang1/Ang2比值。这种作用被ZnPPIX所逆转，HO-1抑制剂。

 

结论：HPX通过HO-1途径维持血脑屏障的完整性，减轻脑I/R后的认知功能障碍。

 

 

背景：认知功能障碍是中风患者生活质量下降的主要原因，众所周知，中风以其高发病率、残疾率、死亡率和复发率闻名于世。但由于其病理机制复杂，治疗时间窗狭窄，临床实践中尚无有效的治疗策略。因此，进一步探索其潜在的信号机制和研究新的有希望的干预措施，以减轻中风导致的认知功能障碍是必要的。新的证据表明缺血再灌注（I/R）损伤在脑卒中发生中起着重要作用。当I/R损伤发生时，内皮损伤和功能障碍导致血脑屏障损伤，进而加重I/R损伤。此外，脑I/R过程中高铁血红蛋白释放的游离血红素是内皮细胞的毒性成分。在已建立的体外和体内模型中，游离血红素对皮质神经元和星形胶质细胞都有毒性。血凝酶（HPX）是一种60 kDa的血清糖蛋白，由中枢神经系统细胞局部合成的。HPX对血红素具有最大的结合亲和力，因此可以作为过量毒性血红素的有效清除剂。我们以前的研究表明，缺血再灌注后24小时半暗带区域的神经元和星形胶质细胞中血红素表达增加。在MCAO后7d内，脑室注射HPX可减少梗死体积，改善神经功能测量。缺血再灌注后，HPX的神经保护作用持续7d。血红素加氧酶1（HO-1）是游离血红素降解的限速酶。新的证据表明，HO-1在保护脑梗塞血脑屏障方面发挥了重要作用。此外，HO-1还可以上调循环内皮祖细胞（EPC）的数量，减轻缺血再灌注损伤引起的多器官损伤。在本研究中，我们设计了实验来探讨HPX是否能改善与脑缺血再灌注损伤相关的认知功能障碍，并确定其是否与HO-1相关。

 

方法：动物：SD大鼠（7-8周龄，体重250-280g），所有动物随机分组 (假手术组，n=36; MCAO n=36; 赋形剂组， n=36; HPX n=36; HPX+ZnPPIX， n=30)。假手术组大鼠接受假手术操作，在其他组，大鼠都接受了MCAO，实验结束后，通过腹腔注射戊巴比妥钠（200 mg/kg）进行安乐死。

 

手术操作：采用大脑中动脉闭塞（MCAO）方法诱导局灶性脑缺血再灌注（I/R）损伤模型。简单地说，大鼠在手术前禁食12小时，不禁水，用水合氯醛（10%，3 ml/kg）腹腔注射麻醉。然后，做腹侧中线颈部切口，然后从周围组织中识别并仔细自由解剖右颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）和颈内动脉（ICA）。在CCA和ECA近端结扎后，将手术用细丝插入ICA，直到感觉到轻微的阻力，表明大脑中动脉（MCA）阻塞，导致MCA供应区域的血流短暂停止，随后出现脑梗塞。皮肤用4–0线缝合，然后缺血1小时。之后，取出手术用细丝，开始再灌注过程。整个过程中，大鼠的体温维持在37±0.5 C。

 

脑室内注射：再灌注后，和之前一样将大鼠麻醉并放置在立体定向框架上。头骨用四颗不锈钢螺丝固定。头皮切口暴露头盖骨和前囟门。在右侧颅骨上钻一个单孔（前囟门外侧1.5 mm，后部0.8 mm）。在硬脑膜表面下方3.5 mm处缓慢插入25μL的微注器，注射生理盐水（10μl，0.9%氯化钠对MCAO组大鼠），赋形剂（10μl），大鼠血凝素参考血清（10μl，1.86μg/L HPX溶于0.1%叠氮化钠）或溶液混合物（10μl，1.86 g/L的HPX＋20μM的ZnPPIX，用于HPX＋ZnPPIX组大鼠）。微量注射器放置5 min，以确保停药前注射的有效性。停药后，缝合切口，让大鼠从麻醉中恢复。假大鼠在不暴露于MCAO损伤和脑室注射的情况下进行相同的手术。

 

Morris水迷宫（MWM）分析：MWM分析包括两部分：空间探针测试和隐藏平台测试。简单地说，测试系统包括一个大的四象限圆形水箱（直径210 cm，高度50 cm），装满水（温度保持在19至22 度，深度30 cm），墙上的彩色卡片在整个实验过程中一直保持不变。在空间测试中，将一个黑色目标平台固定在西南象限中部水面以下1 cm处，确保平台对大鼠不可见。每只大鼠每天进行四次试验，每次试验间隔5分钟，连续5天，并在象限位置随机释放，如下所述。每项试验的最大持续时间为120秒，允许大鼠在水槽中自由游泳，以找到隐藏的平台。发现隐藏平台后，允许大鼠在平台上休息30 min，并将寻找平台所花费的时间记录为它们的逃逸潜伏期。如果大鼠未能在120 s内找到平台，研究人员将其放置在平台上30 s，逃逸延迟记录为120秒。经过5天的测试后，进行了隐藏平台测试。在这个测试中，移除上面描述的隐藏平台，以观察和记录目标象限（象限SW）中花费的时间（时间百分比）和平台交叉口的数量。通过计算机视频跟踪系统记录MWM中的逃逸潜伏期、时间百分比和平台穿越次数。

 

免疫印迹分析：缺血再灌注7天后，处死大鼠快速获得缺血半暗区的脑组织，在液氮中快速冷冻。然后在含有蛋白酶抑制剂的放射免疫沉淀（ripa）分析缓冲液（sigma-aldrich）中研磨缺血半暗带脑组织，获得蛋白质提取物。将每组样品中等量（40μg）的蛋白质样品装入10%十二烷基硫酸钠（SDS）聚丙烯酰胺凝胶的每个通道中，通过电泳分离，然后电转移到PVDF膜上。在室温下用5%脱脂乳封闭2 h后，用以下主要抗体孵育膜：抗HO-1（兔多抗，1:1000稀释），抗VE钙粘蛋白（兔多抗，1:3000稀释）和抗兔β-肌动蛋白（兔多抗，1:1000稀释），并在4°C下轻轻摇动过夜。将膜在TBST中洗涤3次（每次5 min），然后与相应的山羊抗兔抗（1:11000）孵育，在室温下识别结合抗体2 h。将免疫印迹浸入增强化学发光（ECL）试剂中，观察特定蛋白带，然后于ECL中曝光。

 

免疫荧光染色：大鼠在再灌注后7天腹腔麻醉后处死。如前所述将大鼠腹腔内麻醉，并用肝素化生理盐水进行心外灌注，随后用4%多聚甲醛进行心外灌注。灌流后，将大鼠处死，将脑组织从颅骨中取出，将其嵌入OCT培养基中，保存于?80°C。冷冻脑组织的冠状切片（8μm）进行免疫组化染色。CD31和vWF是两个内皮细胞标记物。脱蜡脱水后，用3%过氧化氢在甲醇中处理30 min，抑制非特异性内源性过氧化物酶活性。通过在10 mM柠檬酸缓冲液（pH 6.0）中将切片煮沸10 min进行抗原回收。然后用山羊单抗（mAb）在4摄氏度下对CD31（1:100）和vWF（1:100）进行过夜孵育。然后用PBS洗涤切片，37℃下用生物素化抗山羊IgG（1:100）孵育2h，洗涤切片，然后用亲和素过氧化物酶结合液（1:100）孵育1h。最后，用二氨基联苯胺冲洗5分钟，阴性对照组同样处理，但没有一抗。

CD31和vWF测量：用vWFf和CD31免疫荧光染色法测定脑损伤后的血管密度和CD31阳性细胞数。这里，在光学显微镜（200×）下分析了5个50 mm的脑组织切片。计算病变边界区和损伤海马区的vWF阳性血管。将免疫反应血管除以相应区域，测定两个区域的血管密度和CD31阳性细胞数。

 

脑-血屏障通透性：用埃文斯蓝（EB）染料外渗法评价BBB的通透性。MCAO后2天，在安乐死前1小时，通过股静脉注射EB（2.5%，2 ml/kg）。在灌注4%多聚甲醛后摘取大脑，然后在的二甲基甲酰胺中60℃培养24小时。然后将脑组织匀浆，以1000rpm离心5min。通过测定梯度剂量埃文斯蓝的吸光度绘制标准曲线。在625 nm处检测上清液的吸光度，以计算EB的相对含量。如前所述，用干湿法测量脑水含量，并以湿重的百分比表示。

 

荧光定量PCR:用Trizol从上述冷冻脑组织中提取总RNA。在Smart spec?Plus分光光度计上，用260 nm的OD测量总RNA的浓度。用cDNA合成试剂盒将RNA反转录为cDNA。使用现成的qRT-PCR混合物以50μL的体积进行RT-PCR扩增。所有操作均进行三个平行试验。

 

统计分析：采用单因素方差分析（ANOVA）和Tukey事后检验，比较三组患者的MNSS、MWM和脑组织血管密度。P值0.05被认为具有统计学意义。

 

结果：HPX改善大鼠局灶性脑I/R损伤后的长期空间学习记忆能力：假手术和局灶性脑I/R损伤（?24 h）前5组空间探针测试的基线逃逸潜伏期无显著差异。与假手术组相比，MCAO组在局灶性脑I/R损伤后第2～7天的空间探针测试中的逃逸潜伏期明显延长。在目标象限所花费的时间和隐藏平台测试中平台穿越次数在MCAO组明显低于假手术组。在HPX组，与赋形剂组相比，局灶性脑I/R损伤后第2天至第7天空间探针测试的逃逸潜伏期明显降低。而在目标象限所花费的时间和在隐藏平台测试中的平台穿越次数显著增加。HPX+ZnPPIX组局灶性脑I/R损伤后第2～7天空间探针测试的逃逸时间明显长于HPX组。而在HPX+ZnPPIX组中，在目标象限所花费的时间和隐藏平台测试中的平台穿越次数均显著减少。然而，MCAO和赋形剂组在逃生潜伏期、目标象限所用时间和隐藏平台测试中平台穿越次数方面没有显著差异。

 

HPX治疗组脑缺血半暗带区HO-1表达上调：与假手术组相比，在局灶性脑I/R损伤后第7天，MCAO组缺血半暗带HO-1蛋白表达增加。在HPX组，与MCAO组和载体组的HO-1蛋白表达相比，HO1蛋白表达明显升高。然而，在HO-1蛋白表达水平上，MCAO和赋形剂组之间没有显著差异。

 

HPX改善局灶性脑I/R损伤大鼠缺血半暗带海马新生血管的形成：与假手术组相比，MCAO组在局灶性脑I/R损伤后7天，缺血半暗带海马区新血管密度更高。局灶性脑I/R损伤后7天，同赋形剂组相比，缺血半暗带海马区的新血管密度在接受HPX治疗的患者中显著增加。对局灶性脑I/R损伤大鼠给予HO-1、ZnPPIX和HPX抑制剂后，局灶性脑I/R后7天缺血半影海马区的新生血管密度与HPX组的新生血管密度相比明显下降。然而，赋形剂组局灶性脑I/R损伤后7天缺血半暗带海马区的新血管密度与MCAO组无显著性差异。

 

HPX可预防局灶性脑I/R损伤对血脑屏障（BBB）功能的损害：我通过评估局灶性脑I/R损伤后7天的BBB通透性、脑完整性和新血管稳定性，们评估了通过脑室内注射HPX对减轻BBB结构和功能损伤的作用。与假手术组相比，伊文斯蓝染色的渗出量明显增加，这表明MCAO组的BBB通透性增加。此外，在局灶性脑I/R损伤的大鼠中，水含量测量的脑水肿程度（表明BBB完整性）比假手术组更严重，并且与血管稳定性相关的Ang1/Ang2比值显著降低。VE-钙粘蛋白在内皮细胞迁移和存活、血管生成和维持血管完整性中起着重要作用。VE-钙粘蛋白在MCAO后的表达比假手术组下降。与赋形剂组大鼠相比，HPX组伊文思蓝染料渗出量、含水量和VE-钙粘蛋白水平均明显高于溶媒组。同样，当比较MCAO组和HPX组时，这些变化是一致的。在同时接受HPX和ZnPPIX（HO-1的拮抗剂）的大鼠中，HPX对BBB功能的正作用被阻断。

 

结论：HPX可通过HO-1途径减轻局灶性脑缺血再灌注损伤后的认知功能障碍，预防大鼠血脑屏障的损伤。