1953年，Watson与Crick提出的DNA双螺旋结构拉开了现代分子生物学的序幕，也打开了人类从DNA分子层面深入认识遗传疾病的大门。随着测序和分析技术的不断发展，目前已知的人类遗传病超过6000种，其中3200种为单基因遗传病[1]。虽然人们对遗传疾病的了解和诊断有了长足的发展，但是对于这些疾病的治疗仍然举步维艰：超过95%的遗传疾病都没有有效的治疗方法，更加谈不上治愈。相对于传统的小分子或者酶替代疗法需要不断给药持续治疗，基因治疗有望一次治疗达到长期疗效，是遗传疾病治愈的希望。特别是近几年来基因编辑技术的发展，为疾病的基因治疗提供了一个精准的“手术剪刀”进行基因的插入，缺失以及纠正，极大地提高了基因编辑的精准性和安全性。本期小编就带大家来看看基因编辑技术如何在疾病治疗领域大展身手！ 

基因编辑从功能上一般分为2大类：基因敲除（Knock out, KO），基因敲入（Knock in, KI），本文我们将按照这2种方式结合具体疾病来介绍。

一、基因敲除在基因治疗上的应用及进展

基因敲除（KO）是基因编辑工具的一大基本应用，可以实现特异基因组DNA片段的删除，导致基因失活或激活等。有许多遗传疾病便是与基因的异常表达相关，通过基因编辑工具敲除异常表达的基因或删除突变基因的特定区域，是遗传疾病基因治疗的一大策略。从基因敲除的整体情况上看，基因敲除型基因治疗可以分为三种类型：

第一类：基因的完全敲除

第二类：基因部分功能区域的敲除（如增强子区域）

第三类：杂合子中显性突变基因的敲除

这三类敲除在不同疾病研究中各有应用，为基因治疗提供了广泛的思路。

1. 基因完全敲除策略：在代谢类疾病治疗中最为典型，如：家族性高胆固醇血症和I型酪氨酸血症，通过完全敲除代谢过程中的负调控蛋白或阻断上流代谢通路，间接地治疗疾病。

家族性高胆固醇血症（familial hypercholesterolemia, FH）：FH又称家族性高β脂蛋白血症，是儿童期最常见的遗传性高脂血症，也是脂质代谢疾病中最严重的一种。临床特点是高胆固醇血症、特征性黄色瘤、早发心血管疾病家族史。科学家们发现，一种肝源性分泌丝氨酸蛋白酶PCSK9能促进低密度脂蛋白受体（LDLR）的降解而提高血浆低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）的水平，是降低胆固醇水平和治疗心血管疾病的重要靶点。研究表明利用Cas9敲除肝脏中PCSK9可使血液中低密度脂蛋白胆固醇水平下降35-40%，对家族性高胆固醇血症起到了良好的治疗效果[2]。

图1 全球家族性高胆固醇血症发病分布图[25] 

酪氨酸血症：酪氨酸血症是一种因延胡索酰乙酰乙酸水解酶（fuarylacetoacetate hydrolase, Fah）缺乏引起酪氨酸代谢异常，并引起一系列并发症的疾病。4-羟基苯丙酮酸双氧酶（4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase, Hpd）是酪氨酸分解途径中位于上游的代谢酶，可将4-羟基苯丙酮酸代谢为尿黑酸，而尿黑酸可进一步代谢生成延胡索酰乙酰乙酸。研究者们利用Cas9敲除肝细胞中的Hpd，从而降低进入酪氨酸分解下游代谢途径的尿黑酸，可将严重的I型酪氨酸血症转化为良性的III型酪氨酸血症，起到疾病的治疗作用[3]。

图2 酪氨酸血症代谢异常示意图[26] 

2. 基因部分功能区域敲除：血液疾病和肌营养不良症（duchenne muscular dystrophy, DMD）是其中代表。

β-地中海贫血（β-thalassemia，简称β地贫）：是临床上常见的一种溶血性贫血疾病。β地贫的独特之处在于，β珠蛋白功能或表达上的缺陷可以通过诱导γ珠蛋白的上调来进行补偿[4]。γ珠蛋白是一种在胎儿发育期间表达但在出生后沉默的特殊珠蛋白。γ珠蛋白在成人体内表达下降的一大原因是细胞内存在一种些转录抑制因子，其中以BCL11A分子研究最为透彻[5]。因此，研究者们创新性地提出敲除BCL11A作为治疗β地中海贫血的方法。然而，后续研究观察到在所有造血细胞系中如果不存在BCL11A对于非红细胞样细胞是有害的[6]。有趣的是，科学家们在BCL11A的基因座上发现了一种增强子元件，它特异性地增强红细胞中的BCL11A的表达[7-8]。因此，通过基因编辑技术敲除增强子原件从而起到抑制BCL11A表达的作用，能够在红细胞谱系细胞中实现γ-珠蛋白的上调[7-9]。同样，也可以通过敲除BCL11A的结合位点来解除BCL11A对γ-珠蛋白表达的抑制作用，从而提高γ-珠蛋白的表达[10]。

肌营养不良症：是由肌营养不良蛋白基因（Dmd）发生移码突变引起，并编码不正常的蛋白。不过，科学家们使用基因编辑工具敲除功能突变的一个或多个外显子，产生片段缩短的mRNA，该mRNA仍可翻译成有正常功能的蛋白质[11-13]，该方案有望用以解决大部分DMD患者群体的疾病治疗问题。

图3 BCL11A与地中海贫血症[27] 

3. 杂合子中显性突变基因的敲除：功能获得型突变（gain-of-function mutations）是许多显性遗传病的病因。而对于杂合个体而言，失活一条染色体上的显性基因即可起到疾病治疗的效果。

亨廷顿舞蹈症：亨廷顿舞蹈症（Huntington's disease）是一种罕见的常染色体显性遗传病。患者一般在中年发病,出现运动、认知和精神方面的症状。Jong-Min Lee利用Cas9失活gain-of-fuction的亨廷顿舞蹈症突变基因的研究对于这类显性遗传病的治疗而言具有相当重要的指导意义，此外，治疗前对患者基因突变位点的单核苷酸多态（Single nucleotide polymorphism, SNP）为这类疾病的精准治疗也提供了前提[14]。

遗传性耳聋症：遗传性耳聋的一大原因是患者耳内毛细胞进行声传导的功能出现异常。2018年，David Liu实验室也在Nature上发表文章，利用脂质体递送一种Cas9-gRNA复合体的核糖核蛋白（ribonucleotide protein, RNP）用以失活发生显性突变的Tmc1（transmembrane channel-like gene family 1）基因，对贝多芬模型小鼠的耳聋疾病进行了治疗，缓解了小鼠失聪的症状[15]。

二、基因敲入在基因治疗上的应用及进展

与基因敲除相对应，基因的敲入（KI）是基因治疗的另一种策略，应用于那些关键基因突变失活而导致的遗传疾病。最为传统，应用也最为广泛的是通过同源重组的方式进行基因的敲入。通过同源重组方式进行基因治疗可分为两类：

第一类：点突变修复

第二类：大片段（cDNA）敲入

1. 点突变修复：根据临床病例及相关测序结果统计，由于点突变导致的疾病占人类遗传疾病很大一部分。因此，尤其在CRISPR/Cas9技术出现后通过精准的基因编辑工具进行点突变修复来治疗遗传疾病最为有益。以肝脏疾病为例。

I型酪氨酸血症：除了我们前文所述的通过基因敲除改良代谢通路之外，I型酪氨酸血症还可直接修复突变的Fah基因。研究人员在小鼠模型中分别通过质粒、AAV和纳米材料递送CRISPR/Cas9系统和修复模板进行Fah基因的修复，进而进行体内基因编辑治疗I型遗传性酪氨酸血症的治疗，结果显示都能完全治愈患病小鼠[16]。邦耀科学家李大力研究员课题组在大鼠模型上通过递送nCas9进行在体治疗I型遗传性酪氨酸血症，相比于Cas9，nCas9不仅可以治愈患病大鼠，同时能够很好的降低脱靶[17]。虽然对于I型遗传性酪氨酸血症来说，修复的细胞具有扩增优势，因此只需要修复不到1%的细胞就可以治愈疾病，而对于大多数肝脏类疾病并不适用。但是该类研究是证明在肝脏中用CRISPR/Cas9可以有效进行体内基因编辑的一个里程碑。

B型血友病：对肝细胞没有生长优势的疾病（如由于凝血因子缺乏导致的血友病），李大力研究员课题组也在B型血友病小鼠中利用CRISPR/Cas9技术修复突变的FIX基因，结果表明只需修复肝细胞中0.6%的FIX基因突变就有显著疗效[18]。同时，Nature biotechnology报道通过两个AAV分别递送SaCas9和修复模板治疗因鸟氨酸转氨甲酰酶（ornithine transaminase, OTC）缺乏的高血氨症，在幼鼠的肝细胞中可以达到10%的修复效率，能够很好的治愈疾病，但是在成年鼠中重组效率只有不到2%，没有治疗效果[19]。这也提示成年动物肝细胞同源重组效率较低，还有很大改进的空间。

图4 李大力研究员课题组在B型血友病治疗上取得重要进展[18]

2. 大片段（cDNA）敲入：事实上还有许多病人并不是由于单碱基突变导致的疾病，往往由于不同位置的多个突变或大片段缺失或插入，甚至是基因结构改变等原因导致疾病产生。而对于患这类疾病的病人，大片段（cDNA）敲入的策略毫无疑问是最好的方法，尤其是在基因组的一些安全位点或高表达基因的3' UTR处进行敲入。以B型血友病为例。

B型血友病：B型血友病发病原因较多。除了上文所述的点突变型之外，多点突变和片段缺失也是一大类致病原因。2011年，Li等首先利用ZFN结合AAV载体，将FIX cDNA通过尾静脉注射导入到小鼠体内并实现了有效的整合，这一研究现已经进入临床试验阶段，用于B型血友病新生儿的治疗[20]。

技术不断升级，为疾病治愈再添利器

值得一提的是，无论是通过点突变修复，还是大片段敲入进行基因治疗，都需依赖于细胞的同源重组机制，而同源重组仅只发生于细胞周期的S/G2期，故只能在分裂细胞或器官中实现有效的疾病基因治疗，此外，由于同源重组效率较低，这也成了限制同源重组进行基因治疗的主要障碍[21]。

图5 HDR与NHEJ在细胞中期中的活性

因此，科学家在想办法提高同源重组效率的同时，也在思考如何利用不依赖细胞周期的非同末端连接的机制来进行基因治疗。2016年，科学家新发现了一种非同源末端连接优化后的非同源依赖的靶向整合（homology independent targeted integration, HITI）技术[22]，相比于HDR，HITI第一次在非分裂细胞中成功实现了高效的外源基因靶向敲入，并用于视网膜色素变性大鼠模型的修复。结果表明，HITI介导的体内基因敲入效率可达10%，对视网膜色素变性起到了良好的治疗效果[22]。2017年，杨辉等人设计出一种长同源序列末端连接（homology-mediated end-joining, HMEJ）介导的定点基因整合方式， 这是一种基于CRISPR/Cas9系统，利用sgRNA靶向位点和长同源臂（约800bp）的供体载体来实现高效的精确整合的技术[23]，并利用其导入Fah基因，进行酪氨酸血症的治疗研究，具有一定的疗效[24]。

图6 HITI技术简图[22]

图7 HMEJ技术简图[23] 

综上，介绍了基因编辑技术在不同疾病如何实现基因治疗的过程，可以看到同一疾病可以通过多种手段实现治愈功能，比如在文章中我们多次看到的酪氨酸血症。由于它的致病原因是代谢相关的蛋白的缺失，这种缺失会通过代谢通路影响下游的蛋白和代谢产物。我们可以设计方法直接敲入（修补）疾病本身缺失的基因，也同样可以通过失活/补偿/改造/调整通路中其它蛋白来“曲线救国”，从而达到治疗的目的。而我们强大的基因编辑工具就能够同时起到这样的作用。当然，强大的碱基编辑器和表观遗传操作也在疾病治疗领域贡献着自己的力量。至于它们的贡献如何，就敬请期待我们下一期的文章吧！

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