摘要：本研究的目的是测试神经激肽-1受体（NK-1R）拮抗剂?福沙吡坦?在诱导已建立的角膜新生血管（CNV）退化中的作用。

 

方法：20只C57BL/6小鼠接受碱烧伤。7天后，当角膜新生血管形成时，他们接受了10毫克/毫升的福沙吡坦，每天在右眼局部注射6次，持续10天。同时设置对照组，用生理盐水处理形成角膜新生血管的眼。10只健康小鼠接受相同的局部治疗，持续10天，以评估福沙吡坦的安全性。用Vesselj插件测定血液生成和淋巴管生成。还评估了次要终点，如白细胞浸润、角膜混浊和角膜荧光素染色。用流式细胞仪测定炎症细胞组成。采用未配对t检验、Mann-Whitney U检验或双向方差分析（视情况而定）评估各组之间的差异。

 

结果：局部注射福沙吡坦可显著降低（i）CD31+血角膜新生血管，（ii）lyve1+淋巴角膜新生血管和（iii）CD45+白细胞浸润。此外，福沙吡坦治疗的角膜显示不透明性降低，角膜荧光素染色无损伤，中性粒细胞（-72%）和巨噬细胞浸润减少。局部使用福沙吡坦对眼部表面没有毒性：没有发现结膜炎、混浊、穿孔或角膜荧光素染色的迹象。同样，角膜TUJ1+神经密度没有受到影响。

 

结论：我们的数据表明，NK-1R拮抗剂，如福沙吡坦，可能是一种新的，有希望的治疗工具，以抑制已经建立的CNV。

 

简介：角膜新生血管（CNV）是一个重要的医学领域。全球失明的第二个原因是，目前的治疗选择是有限的。许多化合物，包括抗血管内皮生长因子，已被证明对近期CNV发作的患者有效，而它们在诱导形成的血管退行方面的效果仅限于减少血管口径。从临床角度来看，治疗已经侵入角膜的血管（而不是防止血管生长进入角膜）是非常有益的。本研究的目的是测试NK-1R拮抗剂福沙吡坦诱导角膜新生血管和淋巴管生成的退化效果。广泛的角膜疾病，包括外伤、感染和角膜缘上皮干细胞的丢失，常常与CNV有关，CNV与以下直接相关：（i）视力丧失和（ii）角膜免疫特权丧失。此外，先前存在的CNV的程度与角膜移植排斥反应的风险直接相关。CNV的治疗是有限的。外用类固醇由于抑制炎性细胞迁移和炎性细胞因子分泌而被广泛使用。长期使用类固醇最有效，会导致视力受损的副作用，包括诱导白内障、青光眼和伤口愈合受损。手术或手术治疗，如光动力疗法、细针透热疗法、激光诱导的光凝和结膜、角膜缘或羊膜移植已被用于以可变成功率治疗已建立的CNV。抗血管内皮生长因子药物已在临床试验中用于治疗已有的CNV。局部给药对降低血管口径是有效的，但并未导致新生血管（即侵入区）侵入的角膜面积显著减少。最后，在最近的CNV治疗中，偶尔出现副作用（如上皮缺损、角膜基质变薄、神经毒性）。抗血管内皮生长因子在被周细胞覆盖前对新生血管非常有效，而稳定的CNV则不然。角膜新生血管（CNV）通常与炎症有关。神经源性肽在角膜炎症和CNV中起着关键作用。因为角膜接收到了整个身体最密集的感觉神经。具体来说，P物质（SP）是一种包含11种氨基酸的神经肽，属于速激肽家族，由感觉神经末梢（包括角膜末梢）和炎症期间的各种免疫细胞分泌。P物质通过与高亲和力神经激肽1受体（NK-1R）结合发挥作用。这种受体在神经、免疫细胞和上皮细胞上表达。NK-1R的激活促进淋巴细胞增殖，并诱导炎症介质的释放，如启动和维持CNV所需的白介素和生长因子。先前提出，NK-1R拮抗剂可能在与新生血管相关的眼部疾病中有治疗应用。局部施用高亲和力、竞争性的NK-1R拮抗剂（即拉奈匹坦）可有效阻止CNV的发展。我们测试了选择性NK-1R拮抗剂是否通过在血管侵入至少50%角膜表面后阻断SP来抑制先前存在的CNV。为此，我们使用了NK-1R拮抗剂福沙吡坦，这是一种水溶性的临床批准药物，用于预防恶心和呕吐。福沙吡坦是一种前药，在体内很容易被普遍存在的磷酸酶转化为活性的阿瑞吡坦，这种磷酸酶通过上皮细胞、内皮细胞和角膜细胞在角膜中表达。

 

材料和方法：角膜碱烧伤模型：所有实验（共80只小鼠）均使用6-8周大的雌性C57BL/6小鼠。在60只小鼠的右眼角膜诱导了CNV。简单地说，全麻后，角膜碱烧伤是由2μl的0.15 mM NaOH在角膜中央引起的，用20毫升生理盐水彻底冲洗。随后用角膜刀在与角膜缘平行的旋转运动中刮除角膜上皮。为了防止感染，我们用抗生素软膏治疗眼睛，前3天每天1次。7天后，在裂隙灯显微镜SL 990下检查角膜并拍照。临床测量角膜新生血管，将角膜分为四个象限，评分从0分（无血管）到4分（四个象限的血管）。在60只眼睛中，20只被排除在研究范围之外：5只眼睛穿孔，2只白内障，13只在1个象限内出现新生血管。根据CNV的临床评分系统，将其余眼均匀分为两组（每组20例）。第二个独立实验采用30只小鼠，每组10只眼睛。

 

福沙吡坦治疗：所选两组接受10 mg/ml溶于总体积10μl磷酸盐缓冲溶液（PBS）的福沙吡坦或10μl溶媒对照，每天在右眼局部注射6次，持续10天。治疗开始于角膜损伤后7天，当建立CNV时，至少覆盖角膜表面的50%。我们决定局部给药10倍于用于治疗化疗引起的恶心和呕吐的静脉浓度（1 mg/ml）。因为在初步实验中，1 mg/ml福沙吡坦不能降低CNV和炎症。另外两组10只健康动物（总共20只小鼠）右眼接受10μl 10 mg/ml局部福沙吡坦或PBS，每天6次，持续10天，评估福沙吡坦毒性。

 

每次治疗结束后，在裂隙灯显微镜下进行临床检查，以盲法检查大体病理变化和药物毒性。如前所述，使用评分系统（从0到4；0=完全透明，4=完全不透明）评估角膜不透明度。采用活体角膜荧光素染色法评价福沙吡坦治疗后健康眼和碱烧伤眼角膜上皮缺损情况。在裂隙灯显微镜SL 990的蓝光下拍摄眼睛。用IMAGEJ 1.44P软件分析图像，评价绿色荧光区占角膜总面积的百分比。在7天和17天（分别是治疗前和治疗后时间点），通过图像J分析裂隙灯图像，测量体内CNV侵入面积。

 

角膜新生血管及白细胞浸润分析：在任何治疗结束时，对角膜进行切割、固定和免疫染色，如前所述，标记如下：大鼠抗CD31、山羊抗Lyve1和兔抗CD45。角膜用DAPI复染，平贴，荧光显微镜拍照。一组6个相邻的重叠图像被采集并重新映射成?剪辑组合物，获得整个角膜的二维重建。这些数字图像是使用最近开发的一个名为Vesselj的ImageJ插件进行分析的，该插件可以半自动方式量化角膜血和淋巴血管生成。用共聚焦显微镜对每个视野中的双阳性（DAPI+CD45+）细胞计数来定量CD45+细胞浸润；如前所述，对局部用福沙吡坦治疗的健康角膜进行处理，并对神经标记物TUJ1（兔抗β3微管蛋白多克隆抗体）进行免疫染色，以评估药物的潜在神经毒性。，用影像学方法对福沙吡坦组和媒剂治疗组的外周基底下神经丛进行定量。

 

流式细胞仪分析：在第7天（开始治疗前）和第17天（福沙吡坦或媒剂治疗后），12个角膜/组被切除并汇集。在用20 mM EDTA去除角膜上皮后，用含和，用溶于Ca2+/Mg2+培养基的HBSS溶液中的胶原酶IV（2 mg/ml）和DNA酶I（0.5 mg/ml）处理，使其形成单细胞悬浮液。在37°C下摇动60分钟后，70μm过滤细胞悬浮液，并用含有0.5%BSA/2 mM EDTA的冷PBS洗涤。所有细胞悬浮液均与大鼠抗FcγIII/II受体阻断抗体（1:50）在冰上孵育20分钟。随后，在4°C条件下，用以下主要抗体对其进行染色30分钟，之前滴定的主要抗体有：大鼠抗CD45-PB（1:200）、大鼠抗CD11B-APC-eFluor780（1:800）、大鼠抗Ly6G/Ly6C（GR1）‐PE/Cy7（1:200）和大鼠抗F4/80-FITC（1:100）。细胞在含有7-氨基放线菌素D的缓冲液（1:100）中清洗和重新悬浮。

 

结果：局部应用福沙吡坦可减少稳定的角膜新生血管形成：建立CNV 7天后，将动物分为两组（n=20，每组），按象限测量的CNV和不透明性均匀随机分组。在治疗过程中，每组一只眼发生穿孔（第11天，福沙吡坦；第9天，溶媒），排除在分析范围之外。局部注射福沙吡坦10天可显著减少（i）角膜新生血管和（ii）角膜淋巴新生血管。此外，在第二个实验中，数据得到了证实，显示福沙吡坦治疗的眼睛血管生成减少了33%，淋巴管生成减少了51%。此外，在体内和体外，福沙吡坦治疗的角膜发现血管口径减小。

 

局部使用福沙吡坦可提高角膜透明度，不影响上皮伤口愈合：与溶媒相比，福沙吡坦治疗可有效降低角膜混浊，但与第二个独立实验相比，没有显著性差异。此外，与溶媒组的21%（19个角膜中的4个）相比，福沙吡坦治疗组的47%的眼睛（共19个角膜中的9个）角膜的中心区域没有血管。在这两个实验中，局部应用福沙吡坦并没有降低上皮伤口闭合率。仅在一个实验中，治疗10天后，荧光素染色轻微降低。

 

局部应用福沙吡坦减少角膜炎性细胞浸润：CD45染色分析显示，与溶媒组相比，福沙吡坦治疗后角膜基质中白细胞显著减少。在第二个实验中证实了这种减少。流式细胞术分析显示，药物治疗后角膜中髓样浸润细胞（CD45+7AAD‐CD11B+）的减少率较高。特别是，福沙吡坦诱导了（i）巨噬细胞的显著减少，即骨髓间室中的GR1dimF4/80+细胞，（ii）GR1highF4/80-中性粒细胞.

 

局部使用福沙吡坦对眼表无毒: 经裂隙灯检查评估，局部用福沙吡坦（10 mg/ml，6次/天,连用10天）治疗对健康眼睛的眼表没有毒性：未发现充血/结膜炎或穿孔迹象。此外，治疗后的角膜保持透明。此外，福沙吡坦对角膜上皮没有毒性，荧光素染色阴性。NK-1R拮抗剂对角膜神经没有毒性作用，经抗TUJ1抗体免疫染色的周围基底下神经丛的典型组织学图片和TUJ1+神经量化证实，与溶媒治疗的健康角膜相比，NK-1R拮抗剂对角膜神经没有毒性作用。

 

讨论：P物质通过与受体NK-1R结合来促进CNV。我们最近证明，局部注射NK-1R拮抗剂拉奈匹坦可防止角膜血肿和淋巴管生成。在这两个独立的实验中，我们发现高亲和力的NK-1R拮抗剂福沙吡坦10 mg/ml显著降低了已建立的CNV。除抑制CNV外，福沙吡坦治疗还减少了角膜炎症，我们的免疫染色和流式细胞术数据证实了这一点。众所周知，白细胞，特别是巨噬细胞，表达NK1受体，其激活导致巨噬细胞活性和趋化性增加，并释放促血管生成因子，如SP和VEGF。由于白细胞已被证明有助于角膜生血和淋巴管生成的发展，其治疗后的减少可能减少CNV的作用。因此，可以推测福沙吡坦可能调节炎症细胞的募集和激活状态，最终导致血管密度降低。此外，福沙吡坦还改善了其他炎症相关的临床结果，如角膜透明性和上皮缺损大小。这与我们以前对不同的NK-1R拮抗剂的研究结果一致。最后，局部使用福沙吡坦对眼部表面没有毒性：在健康眼睛上测试时，没有发现结膜炎、穿孔、角膜混浊或上皮缺损的迹象。治疗也不影响基底下神经丛。这与我们之前对其他NK-1R拮抗剂的观察结果一致。

 

结论：福沙吡坦：（i）是目前批准用于临床的唯一水溶性NK-1R拮抗剂，（ii）不表现出明显的眼表毒性，（iii）它有效地降低了动物模型中预先存在的CNV的生长。因此，我们认为福沙吡坦是人类CNV临床试验的理想候选者。