摘要：非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是一种全球性流行病，在普通人群中发病率为20-30%。目前可用的NAFLD动物模型与临床相关性较低。在这项研究中。本研究旨在建立恒河猴NAFLD模型，并建立超声脂肪变性评分（USS）系统，对该模型中的肝脏脂肪变性进行分级。

 

方法：我们对86只恒河猴进行了肝脏超声检查和血液生化检查，其中对45只动物进行了组织病理学分析。

 

结果：恒河猴NAFLD的肝脏组织学特征与NAFLD患者相似。组织学脂肪变性分级与USS密切相关。当USS2时，USS敏感性为87.5%，特异性为94.6%。此外，在USS2-3组中，代谢综合征的患病率明显较高。心脏代谢疾病的多种危险因素，包括肥胖、胰岛素抵抗和血脂异常与USS显著相关。

 

结论：在恒河猴的衰老过程中，NAFLD是自发形成的（随着MetS猴患病率的增加），这为NAFLD提供了一个理想的模型。该系统可用于猕猴脂肪肝的评价。该模型和无创评估方法将为NAFLD新疗法的机制研究和临床前试验提供强有力的工具。

 

 

背景：非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）引起广泛的组织病理学变化，从单纯肝脂肪变性到非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、肝硬化和肝细胞癌。几项长期随访研究表明，与普通人群相比，NAFLD患者的死亡率更高，以肝病、心血管疾病和恶性肿瘤为主要死因。尽管进行了大量的临床和流行病学研究，但对NAFLD的发病机制以及代谢性疾病、心血管疾病和其他NAFLD相关疾病之间的相互作用还不完全清楚。此外，还没有有效的药物可以逆转NAFLD的肝损伤。在基础研究和转化研究中迫切需要足够的NAFLD动物模型。非人类灵长类动物在脂蛋白谱、CVD发病机制、临床治疗反应和遗传组成等方面与人类更为相似。此外，饮食、饮酒、药物等环境因素的可控性，以及组织取样和实时监测疾病表型的可行性，使NHPS成为生物医学研究的理想模式。恒河猴被用作酒精性脂肪肝的模型。Nagarajan等人对5只年龄较大的冠毛猕猴和5只年龄较大的恒河猴进行了NAFLD的研究，发现帽猴与恒河猴相比，具有许多NAFLD的生化和组织病理学特征。包括我们在内的几个研究实验室证明，恒河猴自发地发展出肥胖，伴有衰老、代谢综合征（MetS）和糖尿病。活检是诊断NAFLD的黄金标准，但其侵袭性和可能的并发症排除了它作为一种常规方法评估人类和动物模型中NAFLD。相比之下，无创腹部超声在临床上广泛应用于脂肪肝的筛查和诊断。在一项前瞻性研究中，saverymuttu等人显示腹部超声检查是检测脂肪肝的一种敏感方法。此外，肝脏超声根据一系列特征对肝脏脂肪变性进行分级。然而，在恒河猴中，既无超声图像特征，也无NAFLD诊断标准。 在本研究中，我们的目的是：（1）确定恒河猴队列中NAFLD的自然发生；（2）研究恒河猴NAFLD的组织学和超声特征；（3）建立一种评估恒河猴NAFLD的肝超声方法；（4）比较超声与组织病理学诊断的准确性，验证超声诊断恒河猴肝脂肪变性的标准；（5）探讨恒河猴模型中MetS和nafld的危险因素之间的关系。

 

方法：肝脏超声显像：在对猴的随访观察中，采用改良的人类方案记录肝脏超声图像。简言之，在禁食过夜后，用氯胺酮（10 mg/kg，i.m.）麻醉猴，将其固定在测试台上，去除左侧腹部毛发，仰卧。由训练有素的技术人员采集肝脏图像，并使用GE Vivid 7多普勒超声诊断仪进行记录。所有设置，包括过增益和时间增益补偿，对所有猴都保持相同。所有声像图均在呼吸平稳时记录，并覆盖肝脏的不同区域（叶、缘、门静脉和肝静脉），并记录肝脏和肾脏的对比图像。在一张图像中，肝脏和右肾的右叶都被并排捕获。肝肾回声造影通常在最后一根右肋下获得。探头与脊柱的夹角为30–45°。该探头位于恒河猴的腋前线，而不是人类的腋中线。

 

NAFLD诊断参数：脂肪肝是由一个专门从事超声检查的临床医生诊断。超声脂肪变性评分（USS）用于诊断的依据是四个发现：肝肾回声对比、肝脏明亮、深度衰减和血管模糊。肝肾回声对比是肝肾实质回声的不同。明亮的肝脏意味着来自肝实质的更明亮和更强烈的回声。深度衰减是指超声束在肝脏较深部位的穿透力和振幅减小。血管模糊显示管腔狭窄，肝内血管边界不清晰。

 

脂肪肝的组织学评价：在过去的几年里，有22只猴因为无法治愈的疾病如腹主动脉栓塞、心肌梗塞、心力衰竭、严重的糖尿病或严重的关节炎而被安乐死。这些猴的肝组织固定在4%多聚甲醛（PFA）中，嵌入石蜡中，切割成5微米的切片，然后用苏木精-伊红（HE）和马松三色染色。安乐死前记录腹部超声图像。另外，23只猴腹部超声检查后，由经验丰富的外科医生进行肝脏活检。简言之，在禁食过夜后，用氯胺酮（10 mg/kg，i.m.）麻醉猴，并在活检期间通过吸入2-3%异氟烷保持麻醉。活检前后给予丁丙诺啡（0.01 mg/kg，i.m.）止痛。肝标本固定于4%PFA，石蜡包埋，切片，HE染色。所有切片均由经验丰富的病理学家评估，并根据NAFLD活动评分（NAS）进行半定量评估，该评分包括脂肪变性（0-3）：肝细胞脂肪变性<5%（0）、5-33%（1）、33-66%（2）和66%（3）；小叶炎症（0-3）；以及肝细胞球化（0-2）。

 

血生化和细胞因子/脂肪因子测量：在肝超声成像前，静脉取血，用Cobas C 311分析仪测定血糖和血脂。使用罗氏公司的胰岛素测量试剂盒，COBASE 411分析仪测量胰岛素。用内皮素放射免疫测定试剂盒进行放射免疫测定。ELISA法测量IL-1B，IL-2，IL-6，脂联素和瘦素。

 

结果：恒河猴NAFLD的超声分级及其与组织学的关系：超声造影显示肝的超声图像被USS分为四个级别（0-3），并与组织学变化进行比较。如果肾脏的肝肾回声对比度较高，没有肝脏明亮，没有深度衰减，没有血管模糊，没有组织学证据显示脂肪变性则分级为USS0（正常）。如果肝肾回声对比度和肝明亮均为阴性，未见深部衰减或血管模糊。如果肝脏的肝肾回声对比度较高，同时伴有轻度肝亮、阴性或轻度深部衰减和阴性血管模糊，则分级为USS2（中度脂肪变性），肝脏切片中有50%的脂肪变性细胞。肝内肝肾回声对比明显增高，伴有肝亮、肝衰减、血管模糊，分级为USS3（重度脂肪变性），肝切片组织学脂肪变性约80%。USS与组织病理学观察有显著相关性，Spearman系数为0.705。

 

NAFLD猴的典型组织学变化：猴NAFLD的组织学特征包括大泡性脂肪变性和小泡性脂肪变性。除了肝脂肪变性，我们还发现炎症和窦周纤维化。所有这些特征与NAFLD和NASH患者的病理结果相似。在USS和炎症或纤维化之间没有发现明显的相关性。

 

MetS猴肝脏脂肪变性的患病率：在我们之前的研究中，我们已经报道了一些猴随着年龄的增长而自发地产生MetS。当猴显示≥3 MetS组成部分时，诊断为MetS猴。MetS组成部分为：（1）腰围（wc）≥40 cm，腰臀比≥0.9，（2）空腹血糖（fpg）≥4.40 mmol/L，（3）甘油三酯（tg）≥0.90 mmol/L，（4）高密度脂蛋白胆固醇（hdl-c）≤1.55 mmol/L，（5）血压≥130/80 mmHg。通过分析超声图像，发现MetS猴中肝脏脂肪变性的患病率明显较高。28只MetS猴中，14只为中度至重度脂肪肝（50.0%）。58只非MetS猴中只有11只（19.0%）有NAFLD。21.4%的MetS猴有严重的肝脂肪变性，明显高于非MetS猴（5.1%）。随着年龄的增长，NAFLD和MetS的发病率增加，MetS猴更容易自发发生NAFLD。

 

不同USS值猴的临床特征：我们评估了86只猴的USS和临床特征之间的相关性。USS2-3组的收缩压、体重（BW）、体重指数（BMI）、WC、fpg、胰岛素抵抗的稳态模型评估（HOMA-IR）、TG、总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇显著升高。USS2-3组的HDL-C明显较低。两组间的丙氨酸转氨酶（ALT）和天冬氨酸转氨酶（AST）差异无统计学意义。BW、BMI、WC、胰岛素、HOMA-IR和TG与USS显著相关.。.这些结果表明，肥胖、TG和胰岛素抵抗（IR）与USS密切相关。

 

重度NAFLD猴的脂联素水平降低：我们检测了NAFLD和非NAFLD猴的血浆细胞因子和脂肪因子水平，发现USS0-1和USS2-3组间的TNF-α、IL-1β、IL-2和IL-6没有差异，这些细胞因子与USS之间也没有相关性。uss2-3组脂联素显著降低，与uss呈负相关；而两组间瘦素无显著差异。

 

结论：研究结果表明，年龄较大的恒河猴，尤其是患有 MetS的恒河猴，更容易自发发生NAFLD，这可以用无创超声方法进行筛选。