目的:利用双重 sgRNAs 构建 miR-223 全基因敲除小鼠｡

方法:针对 miR-223 基因设计双重 sgRNAs,将体外转录的sgRNAs和Cas9mRNA共同显微注射入C57BL/6小鼠受精卵细胞｡ 小鼠出生后取其基因组 DNA进行PCR扩增和测序以鉴定基因型,同时取小鼠肝脏研磨后提取总RNA,通过real-timePCR分析miR-223在 肝脏中的表达｡

结果:设计了miR-223 基因双重sgRNAs并对其进行了体外转录,纯化后显微注射小鼠受精卵细 胞获得miR-223基因突变小鼠｡ 测序结果表明突变小鼠有3种基因型,一种为6bp的缺失突变,但未对miR-223 序列产生影响;另外两种为162bp和168bp的缺失突变,完全删除miR-223前体和成熟区序列｡ 与野生型相比,这 两种小鼠肝组织中几乎不能检测到miR-223的表达｡

结论:设计双重sgRNAs并应用CRISPR/Cas9技术成功构建 miR-223全基因敲除小鼠｡

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