摘要：在本研究中，我们利用斑马鱼（Danio rerio）模型揭示了Hace1（含E3泛素蛋白连接酶1的Hace1结构域和锚蛋白重复序列）肿瘤抑制蛋白在正常脊椎动物心脏发育中的一个以前未被描述的作用。我们研究了与Hace1功能丧失相关的心脏表型与rho小家族GTPase，Rac1表达之间的联系，rho小家族GTPase，Rac1是Hace1的已知靶点，通过与nadph氧化酶全酶的相互作用促进ROS的产生。结果：通过反义寡聚核苷酸敲除斑马鱼的Hace1基因，导致心脏畸形，尤其是循环缺陷，心脏呈管状或“倒置”。心脏标记物的整体原位杂交显示变形心脏的心室形态和房室瓣膜形成明显异常，以及Rac1表达增加。这种表型似乎与氮氧化物酶依赖性活性氧的产生直接相关。重要的是，这一表型似乎与氮氧化物酶依赖性活性氧的产生直接相关，因为Nox1和Nox2反义寡聚核苷酸的基因抑制或使用活性氧清除剂的药物治疗恢复了正常的心脏结构。结论：Hace1通过活性氧依赖机制对脊椎动物心脏的正常发育和正常功能至关重要。

 

简介：含E3泛素蛋白连接酶1（Hace1）的Hect结构域和锚蛋白重复序列是一种泛素化酶，由位于人类染色体6q21上的基因编码，首次被描述为在散发性Wilms肿瘤的发生中具有潜在作用。在鉴定Hace1之前，发现6号染色体这一区域的杂合子缺失与多种恶性肿瘤有关，包括黑色素瘤、乳腺癌和前列腺癌。wilms肿瘤中Hace1表达的缺失与Hace1基因位点的表观遗传失调有关，并且异常的Hace1甲基化已经在胃癌和结直肠癌等其他恶性肿瘤中被描述。在成神经细胞瘤中也描述了Hace1基因变异，其中Hace1表达降低与高风险肿瘤和低总体生存率有关。因此，Hace1是一种有效的肿瘤抑制基因，在许多恶性肿瘤中具有广泛的代表性。Rac1是一种多功能蛋白，可能通过与肌动蛋白板状足和局灶性粘连的结合，影响血管的发育以及细胞的运动和粘附。Rac1的过度表达也与多种癌症的进展有关。当处于激活的GTP结合构象状态时，Rac1通过激活细胞溶质烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nadph）复合物来诱导细胞活性氧生成。膜结合的NADPH氧化酶（Nox）在人类中有七种不同的同源物（Nox 1–5、duox 1和duox 2），每种同源物形成独特的多单位酶复合物，涉及几个辅助蛋白。Rac1显然是激活Nox1和Nox2酶以及潜在的Nox3所必需的。活性氧作为细胞信号分子和凋亡调节器发挥作用。然而，在压力条件下，活性氧可以增加到毒性水平，并有助于各种病理，包括癌症。我们先前揭示了Hace1在小鼠和斑马鱼模型中调节Rac1和ROS诱导的DNA损伤的新功能。在Hace1/小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）和组织切片以及Hace1变形斑马鱼胚胎中，基线Nox介导的ROS水平显著升高。在使用二苯碘铵（DPI）、一种氮氧化物抑制剂或全氧化物抑制剂APO治疗后，Hace1变形剂中的活性氧水平升高恢复到基线水平。Hace1在正常发育中的具体作用尚不清楚。斑马鱼（Danio rerio）是研究脊椎动物发育和疾病的一种强大的模式生物。在我们之前的研究中，我们发现Hace1在斑马鱼的蛋白质水平上高度保守，在脑、肾和心脏组织中观察到表达水平升高。最近，Iimura等人证明在非洲爪蟾胚胎中，反义寡聚核苷酸敲除Hace1可导致多种发育缺陷，这可能是由于Rac1水平的升高引起的。在目前的研究中，基于斑马鱼心脏中Hace1的显著表达，我们进一步研究了Hace1在心脏发育中的作用和潜在的作用机制。我们发现，Hace1斑马鱼的变形体在心脏形态发生方面具有与活性氧水平升高相关的特征性缺陷，可通过抗氧化化合物有效改善。.这些发现首次将Hace1和ROS产生与脊椎动物心脏发育联系起来。

 

方法：所有斑马鱼胚胎均在28度，含E3胚胎培养基（5 mM Nacl，0.17 mM KCl，0.33 mM CaCl2，0.33 mM MgSO4）。的10cm培养皿中培养。TG（myl7:：egfp）twu34斑马鱼，并在心肌细胞中特异性表达gfp。为防止色素形成，E3培养基中添加N-苯基硫脲，最终浓度为0.2 mM。用野生型Tubingen（tu）鱼进行RNA测序，，用AB和casper鱼完成wish实验。TG（myl7:：egfp）twu34斑马鱼，在心肌细胞中特异性表达GFP。用DCFH-DA染色监测活性氧的积累，我们使用了TG（cmlc2:：mcherry-ras）SD21，其中心肌细胞表达红色荧光蛋白mcherry。

 

Hace1、Rac1、Nox1和Nox2反义寡聚核苷酸：Hace1‐HECT (5′‐CCCTCGAACTGTTAGACAGAATAAA‐3′) 和标准对照品(5′-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA‐3′) 。Hace1反义寡聚核苷酸剪接位点位于催化活性HECT域内，Hace1泛素连接酶功能所需的关键半胱氨酸残基上游。如Daugaard等人所述，通过RT-PCR对Hace1的敲除进行了验证。剪接位点–将Rac1(5′-CCACACACTTTATGGCCTGCATCTG‐3′)、Nox1(5′‐AGGTAAATAAACGCTCTTACCACGA‐3′)和p91phox(Nox2; 5′‐CATAATCCCGATAGCTTACGATAAC‐3′)阻断反义寡聚核苷酸用0.05%酚红稀释至工作浓度（Hace1和Rac1为1.6 mM；Nox1、Nox2为1mM和Nox1/no为1 mM），并在1-4细胞阶段使用来自哈佛的pli-100注射到斑马鱼胚胎中。

 

幼虫心脏表型的分类：在48 hpf时，用Leica MZ对未经感知的存活TG（myl7:：egfp）胚胎进行分类，以获得特定的心脏表型。鱼被分为三组：正常（幼虫具有正常的环心表型，心室朝向鱼的右侧）；直的（幼虫显示出完全或部分未闭环的心脏）；倒置（幼虫有一个心脏，心室环绕在鱼的左侧，从而形成与正常心脏表型一致的镜像）。每一显型组的胚胎数被计算出来，并以总胚胎数的百分比表示。

 

测量幼虫心率：根据心脏表型分类后，在上述相同的显微镜条件下直接观察未经感知胚胎的心率。在48 hpf时，胚胎具有足够低的偶发性游动行为，因此心脏可以在不运动的情况下长时间被观察到。在控制温度（28.5°C–30°C）下计算心跳15秒，心跳次数乘以4，得到每分钟心跳的最终值。

 

整体原位杂交（WISH）:根据制造商的方案，从线性化的cDNA结构中转录用于NPPA、AMHC、VMHC和BMP4的二氧基生成素（digoxgenin，dig）和荧光素异硫氰酸盐（fitc）标记反义RNA探针。斑马鱼胚胎的WISH分析如前所述进行。对于BMP4的整体原位杂交，半定量评分是盲目完成的。心直或正常的Hace1基因型和对照基因型被分为0到2个等级；0代表无表达，1代表表达下降，2代表正常表达，这是斑马鱼胚胎中的最高表达量。

 

斑马鱼活性氧的染色和成像:用活细胞荧光素染料对整个斑马鱼幼虫进行活性氧分析.简言之，48-hpf变形胚胎用50μM乙酰-五氟苯磺酰荧光素或5-50μM 2′，7′-DCFH-DA在E3胚胎培养基中的1%二甲基亚砜（DMSO）中孵育45分钟至1小时，并用一个550-nm带通滤波器用莱卡DFC 490 Ca成像。在共聚焦成像中，将整个斑马鱼幼体在带有1号盖玻片的定制Lexan凹陷载玻片中的3%甲基纤维素中进行分离和固定。采集到的共聚焦图像用蔡司Zen2009软件处理，图像用photoshop cs6处理成图形板。

 

结果：Hace1基因敲除导致斑马鱼胚胎心脏环缺损和心动过缓：吗啉代反义寡核苷酸（mos）在进行反向遗传分析方面具有明显的优势。在野生型胚胎中注射Hace1剪接位点反义寡聚核苷酸显示心脏发育异常，利用肌球蛋白轻多肽7调节（myl7）探针，通过整体原位杂交（wish）发现管状心脏，而不是由于心脏循环形成S形结构。接下来，我们使用TG（myl7:：egfp）转基因系，该系在myl7启动子下仅在心肌中表达绿色荧光蛋白（gfp），以便更容易地观察这些胚胎的心脏形态。在受精后48小时，TG（myl7:：egfp）Hace1基因型表现为一个环状缺陷，导致两种不同的心脏表型：直管状心脏和倒置心脏，其中心房和心室位于其正常方向的对面，心室位于心房的左侧。除这些结构异常外，Hace1缺失导致心动过缓，这在具有直心表型的变形胚胎中最为明显。Hace1变形体结构正常心脏的心率明显低于对照变形体胚胎的心率，这表明所观察到的心动过缓与心脏结构缺陷无关。将Hace1反义寡聚核苷酸与人Hace1 mRNA共注射成功地挽救了心脏结构表型和心动过缓，证实了Hace1缺失的特异性是这些异常的病因。观察到的心脏表型促进了血管发育的评估。然而，采用TG（fli1a:：egfp）转基因幼虫，其中内皮细胞用gfp标记，我们发现Hace1变形体和对照组的血管发育是完整的。

 

利用心脏特异性标记对Hace1变形体进行原位杂交，显示异常的表达模式：我们通过对心房肌球蛋白重链（amhc）和心室肌球蛋白重链（vmc）表达的wish分析证实了我们在48 hpf时观察到的Hace1变形斑马鱼幼虫心脏异常。当心脏循环在48 hpf前完成时，AMHC表达的心房和VMHC表达的心室在形态上有所不同。最显著的变化是在心室而不是心房结构。与对照组相比，Hace1变形鱼的心室更长、更薄。利钠肽前体A（NPPA）标记鱼心肌，通常不存在于房室交界处。利用NPPA探针，我们发现在Hace1变形体中，AV边界的形成似乎丢失或中断。骨形态发生蛋白（BMP）参与许多细胞过程，包括细胞分化和迁移，是心脏形态发生的关键过程。因此，我们检测了bmp4的表达，bmp4是一种已知的调节斑马鱼心脏左/右形态发生的调节因子。在48 hpf时，与对照组相比，Hace1变形体（心脏直或正常）的bmp4表达显著降低，我们采用半定量盲评分法对其进行量化。

 

在Hace1型斑马鱼的心脏中观察到活性氧水平升高：在我们之前的研究中，我们用H2O2选择性荧光探针乙酰-五氟苯磺酰荧光素敲除Hace1后，我们发现斑马鱼整个胚胎中的ROS水平升高。由于斑马鱼体内的双氧酶和氮氧化物酶产生的超氧化物能够有效地转化为H2O2，部分原因是超氧化物歧化酶（SOD）酶的作用，因此使用上述的H2O2指示染料来监测总的ROS升高。我们使用细胞渗透性ROS探针2′，7′-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）。DCFH-DA与TG（cmlc2:：mcherry-ras）SD21胚胎联合使用，后者在心肌中仅表达心肌肌球蛋白轻链2启动子下的膜结合mcherry。注射对照反义寡聚核苷酸的TG（cmlc2:：mcherry‐ras）sd21和野生型胚胎均显示心脏结构正常，心脏和整个有机体在48 hpf时的活性氧基线水平正常。Hace1基因型在整个胚胎中表现出异常的心脏环表型和ROS（绿色荧光）的增加，尤其是心脏结构中的ROS显著增加。

 

Hace1基因敲除导致整个胚胎和心脏Rac1过度表达：Rac1在心血管系统中起着关键作用。研究已经证明了Rac1的不同作用，包括在血管平滑肌细胞（vsmcs）增殖和迁移中的重要作用，以及它在心肌细胞肥大中的作用。从临床角度来看，严重心力衰竭患者中，NADPH氧化酶介导的ROS生成增加与Rac1活性和膜表达增加相关。在我们的斑马鱼模型中，对Rac1（Rac1a）的WISH表明，在Hace1-变形胚胎中的表达水平增加，在变形心脏中检测到特异性表达，而在对照胚胎中则没有。（RT-PCR）同样显示，在Hace1基因型中，Rac1的表达较高.此外，对对照组和Hace1反义寡聚核苷酸注射胚胎进行RNA-Seq分析，以鉴定表达改变的基因。虽然在斑马鱼中尚未得到证实，但在人类中，Hace1泛素化Rac1可被蛋白酶体降解。

 

Nox1和Nox2基因敲除或用NADPH氧化酶抑制剂治疗可挽救心脏异常和ROS升高:已发现Rac1对激活含Nox1、2和3的NADPH氧化酶至关重要。考虑到斑马鱼基因组编码Nox1、2、4和5，我们研究了Rac1依赖性氮氧化物酶在诱导Hace1变形体的活性氧和心脏异常中的可能作用。我们将Nox1和Nox2剪接位点反义寡聚核苷酸单独注射在一起，并与Hace1反义寡聚核苷酸联合注射，以比较结果。Nox1和Nox2基因敲除以及Nox1/Nox2基因双敲除都降低了整个胚胎的ROS生成，维持了正常的心脏发育。敲除Nox1、Nox2和Hace1表明活性氧水平和正常心脏表型降低，揭示了Hace1和Rac1依赖性NADPH氧化酶、Nox1和Nox2之间的直接相关性。

 

结论：Hace1通过活性氧依赖机制对脊椎动物心脏的正常发育和正常功能至关重要。