摘要：背景：红细胞是血液中最丰富的向全身输送氧气的细胞。促红细胞生成素（EPO）是红细胞生成的一种积极调节因子，是目前治疗慢性贫血的主要方法。粒细胞集落刺激因子（G-CSF）是一种多功能细胞因子，是造血干细胞增殖、分化和动员的调节因子。据报道，在一组骨髓增生异常综合征患者中，EPO与G-CSF联合使用可协同改善红细胞反应，而这些患者单独接受EPO治疗后没有反应；然而，其机制尚不清楚。

 

方法：用流式细胞术观察注射G-CSF或EPO的C57BL/6J小鼠红细胞生成情况和红细胞动员效率。

 

结果：在这项研究中，G-CSF在骨髓和脾脏中比EPO诱导更多的原色性红细胞生成。此外，与EPO治疗相比，G-CSF处理提高了新合成的网织红细胞向外周血的动员效率。我们的研究结果表明，G-CSF对红细胞生成和红细胞动员的影响与EPO分泌无关，与EPO相比，G-CSF通过早期r2（嗜碱性红细胞）到晚期r4（原嗜色红细胞）的转变促进红细胞生成的进展。

 

结论：我们首次证明G-CSF治疗比EPO诱导更快的红细胞生成增强反应。这些发现提示了一种治疗急性贫血的替代方法，特别是当患者在偏远地区出现临床紧急情况而没有适当的血库供应时。

 

 

背景：红细胞（RBC）是血液中含量最丰富的细胞，对氧在体内的传输至关重要。出生后，红细胞生成的部位从胎儿的肝脏转移到骨髓（BM）和脾脏。在人类中，骨髓是稳定红细胞生成的主要部位。相反，在小鼠中，除了骨髓外，脾脏在稳态红细胞生成中起着次要作用（10%）。在诸如出血或急性贫血等应激状态下，人和小鼠的脾脏在应激性红细胞生成中起主要作用。造血干细胞（HSCs）存在于骨髓其中由内皮细胞、成骨细胞和巨噬细胞组成的基质细胞产生的细胞因子或信号调节包括红细胞在内的各种血液系的分化。HSCS首先分化为巨核细胞红系祖细胞，随后形成爆式红细胞集落形成细胞 (BFU-Es),形成红细胞系集落形成细胞 (CFU-Es)。CFU-es比BFU-es更成熟，此外，CFU在甲基纤维素中培养时形成的集落比BFU小。促红细胞生成素（EPO）是一种主要由肾脏合成的30.4kDa糖蛋白，是红细胞增殖、分化和存活的主要调节因子。在缺氧条件下，通过低氧诱导转录因子（HIF），EPO的生成被上调。EPO受体（EPOr）主要在CFU-ES上表达，在红细胞分化过程中逐渐下调。在EPO结合到EPORS的刺激下，CFU ES发展为原红细胞，随后发展为嗜碱性红细胞，然后是多色红细胞，最后发展为嗜碱性红细胞。红细胞分化的最后阶段包括将网织红细胞去核，并成熟为循环红细胞。红细胞减少、红细胞生成减少、红细胞破坏增加或红细胞寿命缩短可导致贫血。世界卫生组织将贫血定义为女性血红蛋白水平低于12 g/dl，男性低于13 g/dl。除遗传性造血疾病患者外，慢性病患者（如肾脏和心脏病、癌症、炎症性肠病、类风湿性关节炎和人类免疫缺陷病毒（HIV））的贫血发生率最高。然而，自1998年以来，一些严重的不良反应，如长期注射EPO诱导的中和抗体导致的EPO相关的纯红细胞再生障碍已被报道。其他副作用如高血压、静脉血栓栓塞、中风和死亡的风险也有报道。目前可用的促红细胞生成刺激剂（ESA）是人类细胞或中国仓鼠卵巢细胞产生的EPO的变体。新的ESA（例如肽基红细胞生成剂）、通过HIF稳定和GATA1抑制激活内源性EPO生成以及EPO基因治疗已经开发。然而，这些新方法都没有显示出优于现有ESA的疗效。我们以前的研究发现，粒细胞集落刺激因子（G-CSF）能够将新合成的红细胞动员到外周血（PB），促进红细胞在体外和离体的分化和增殖。本研究进一步探讨了G-CSF与EPO对红细胞生成的影响。用G-CSF和EPO处理小鼠后，用流式细胞仪比较BM和脾脏的红细胞生成情况。对早期红系祖细胞亚群的刺激和红系祖细胞动员的时间调节进行了研究。探讨了G-CSF促进红细胞生成的机制。

 

方法：B.炭疽致命毒素（LT）由台湾台北市国防医学中心预防医学研究所提供，如前所述纯化。EGFP小鼠[C57BL/6J-Tg（Pgk1-EGFP）03narl]和C57BL6J小鼠从国家实验动物中心购买。

 

骨髓和脾脏红细胞生成状况分析:将C57BL/6 J小鼠（雄性，10-12周龄）尾静脉注射2 IU/g rhEPO或55μg/kg重组人G-CSF，连续3天每天一次。用相同体积的生理盐水给药作为阴性对照。如前所述分离BM细胞。用50毫升注射器的柱塞粉碎脾脏，用P1000移液管重新悬浮，形成单细胞悬浮液。在37℃下，用含有5%牛血清白蛋白的RPMI-1640培养基封闭细胞1小时。随后用大鼠抗鼠异硫氰酸荧光素结合CD71抗体（BioLegend）和大鼠抗鼠异种球蛋白（APC）-结合的ter-119抗体（BD免疫细胞测定系统）在37℃孵育1h。用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤后，将细胞重新悬浮在1 ml PBS中，并使用Beckman Coulter Gallios?流式细胞仪进行分析。

 

EGFP小鼠红细胞动员的流式细胞术分析：增强型绿色荧光蛋白（egfp）小鼠（雄性，8月龄）在连续3天的时间内，每天一次尾静脉注射55μg/kg G-CSF或2IU/g EPO。首次注射后20、40和60小时，尾静脉采集外周血。用大鼠抗鼠APC结合的ter-119抗体在37℃孵育1小时。随后用5μm的RNA选择性染料F22在37°C下处理30分钟。用PBS洗涤后，使用Beckman Coulter Gallios?流式细胞仪分析细胞。

 

EPO和可溶性P-选择素免疫分析：对C57BL/6J小鼠（雄性，10-12周龄）进行的眼眶后注射55μg/kg G-CSF，连续2天每天一次进行EPO免疫测定，连续5天每天一次进行可溶性p-选择素免疫测定。用相同体积的生理盐水治疗的动物作为阴性对照。在初始注射后22, 44小时和66小时后，采集PB用于EPO免疫分析。可溶性P-选择素免疫分析的初始注射前第0天和初始注射后第1-5天。根据制造商的说明，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）进行EPO和可溶性P-选择素免疫分析。

 

造血参数检测：用55μg/kg G-CSF或1 mg/kg重组小鼠p-选择素对c57bl/6 J小鼠（雄性，10-12周龄）连续2天每天一次通过眼眶后注射进行治疗。使用自动血液分析仪在初次注射后第2天测量造血参数。

 

结果：G-CSF比EPO在BM和脾脏中更能促进R4红细胞生成:为了比较G-CSF和EPO给药后的红细胞生成情况，对C57BL/6J小鼠进行了连续3天的G-CSF或EPO尾静脉注射。通过流式细胞仪分析骨髓和脾脏的红细胞生成进展。使用抗红系标记物CD71和Ter119的抗体，将红细胞分为以下四个群体，从早期到晚期依次分化：原红细胞（R1），嗜碱性红细胞（R2），晚期嗜碱性和多色嗜酸性红细胞（R3，），和原色嗜红细胞（R4）。与其他研究结果一致的是，在小鼠骨髓中，G-CSF比EPO增强更多的非淋巴样细胞群，EPO显著增加了红细胞总数。尽管G-CSF给药组小鼠骨髓中的总红细胞计数低于EPO给药组小鼠，但G-CSF诱导的R4种群明显大于EPO给药组。脾是红细胞生成的次级器官，而不是粒细胞生成的次级器官。在描述小鼠脾脏的分化进程时，我们发现G-CSF治疗不会增加非淋巴球细胞数量或总红细胞数量。与BM的效果相比，EPO上调了早期红细胞（R1和R2）的百分比，下调了晚期红细胞（R3和R4），而G-CSF则降低了早期R1、R2和R3细胞的百分比，显著增加了晚期R4红细胞的数量。这些结果共同表明，G-CSF比EPO在小鼠骨髓和脾脏中更能促进红细胞生成。

 

G-CSF比EPO动员更多新合成的网织红细胞：利用一个EGFP转基因小鼠模型，我们发现G-CSF使新合成的红细胞动员到PB中，诱导红细胞以比EPO更快的速度进入外周血。在采用相同的实验策略后，我们的数据显示，G-CSF处理后20 h，新合成的红细胞（R1）的动员效率高于EPO处理，G-CSF和EPO初始注射后40和60 h后，动员效率相似。因为G-CSF比EPO在BM和脾脏中促进更多的R4红细胞合成，我们假设G-CSF比EPO更能促进网织红细胞动员。由于在新合成的红细胞群体中，只有网织红细胞表现出残余的核糖核酸（RNA）表达，因此用一种RNA选择性染料F22结合ter-119来区分网织红细胞和新合成红细胞中的成熟红细胞。在20和40小时的两个时间过程中，G-CSF比EPO更倾向于调动新合成的网织红细胞。

 

H-CSF依赖性红细胞生成增强和红细胞动员不是通过诱导EPO和P-选择素途径介导的：G-CSF可上调转录因子HIF-1α，然后与一个EPO启动子结合，连续5次G-CSF注射后增加循环中的EPO水平。我们假设G-CSF可以通过增加EPO的合成来刺激红细胞生成和动员红细胞。用炭疽杆菌（一种能诱导小鼠缺氧诱导EPO分泌的LT）作为阳性对照。与先前的研究一致，我们的研究结果显示，小鼠在长期给药后，循环中EPO水平逐渐增加。相比之下，G-CSF治疗小鼠后所有检查时间点的循环中EPO水平没有上调。结果表明，G-CSF依赖性红细胞生成增强和红细胞动员不是通过诱导EPO介导的。P-选择素被广泛认为是一种通过与主要配体P-选择素糖蛋白配体1（PSGL-1）的糖基化部分结合来调节白细胞滚动的细胞粘附受体。通过p-选择素（hsc）–psgl-1（stroma）的相互作用，p-选择素的相同性质使hscS粘附在基质细胞，特别是囊泡内皮细胞上。G-CSF诱导PSGL-1敲除小鼠比野生型小鼠的骨髓样细胞更快更大的动员。研究还表明，G-CSF给药增加了循环可溶性P-选择素的水平。这些证据共同表明，P-选择素/PSGL-1介导的红系前体和基质细胞之间的结合可能部分控制祖细胞从BM向血流中的动员和释放，因此提示G-CSF可能通过诱导循环可溶性P-选择素与P-选择素/PSGL-1介导的前体-基质相互作用来增强红细胞动员。为了重现循环可溶性P-选择素G-CSF介导的诱导作用，连续5天将G-CSF注射到C57BL/6J小鼠体内。G-CSF注射后循环可溶性P-选择素水平显著升高。我们设计了一个实验来检验可溶性P-选择素是否能增加外周血中的红细胞计数。尽管两种剂量的G-CSF增加了外周血中白细胞（WBC）和红细胞计数，但当使用两种同等剂量的可溶性P-选择素时，没有观察到同样的效果。这一发现表明G-CSF动员红细胞进入外周血主要不是通过P-选择素途径介导的。

 

结论：尽管G-CSF联合EPO治疗MDS、再生障碍性贫血和HIV患者的贫血已有多年，但G-CSF促进红细胞生成的机制仍不清楚。本研究表明G-CSF促进红细胞生成，与EPO和可溶性P-选择素的分泌无关。此外，G-CSF比EPO在BM和脾脏中更大程度地诱导了R4红细胞的产生，用G-CSF治疗比EPO动员更多新合成的网织红细胞到PB。