摘要：长期饮酒是世界范围内慢性肝病的主要病因。成年斑马鱼已成为一种新的乙醇性肝病脊椎动物模型。在先前的研究中，高剂量的乙醇慢性暴露诱导成年斑马鱼脂肪变性和肝损伤的特征性症状，但该研究中的乙醇浓度明显高于人类致死剂量。在目前的研究中，我们检测了成年斑马鱼低剂量慢性乙醇暴露是否会导致乙醇性肝病的代谢和病理特征。我们发现，0.2%乙醇（v/v）浓度的慢性乙醇处理4周后，成年斑马鱼的血糖和三酰甘油显著升高。乙醇处理后血清丙氨酸转氨酶活性显著升高。组织学分析显示脂肪变性和肝细胞膨胀表型。用定量实时PCR技术对基因表达进行分析表明，乙醇治疗可诱导炎症、细胞凋亡和纤维化。此外，我们发现与糖、脂代谢及线粒体生物发生和功能有关的基因表达显著增加。重要的是，在乙醇性肝病肝损伤中涉及氧化和内质网应激的基因的表达在成年乙醇斑马鱼肝脏中高度上调。综上所述，我们发现4周的低剂量乙醇暴露导致典型的乙醇性肝病，具有病理和基因表达模式。

 

 

简介：乙醇性肝病（ALD）患者表现出广泛的缺陷，从单纯脂肪变性到脂肪性肝炎、纤维化、肝硬化和肝细胞癌。为了研究ALD的病理生理和治疗，建立一个合适的动物模型是非常必要的。最近的一项研究将成年斑马鱼作为慢性乙醇性肝病的模型，研究表明，慢性乙醇治疗（1%乙醇v/v）可使乙醇性肝病在治疗2-12周后由单纯脂肪变性发展为纤维化。但人体内乙醇浓度仍高于致死浓度（>0.5%）。此外，我们最近发现，成年斑马鱼在1%乙醇处理过程中食欲不振，这可能影响乙醇性肝病的发病机制。另一项对成年斑马鱼ALD的研究表明，高剂量乙醇处理（0.5%）2-4周足以诱发一系列ALD症状，从脂肪变性到肝损伤，包括纤维化。然而，这两项研究都集中在肝脏的病理学分析和与炎症和脂肪生成有关的肝脏标志基因表达的变化；目前还没有研究与肝损伤直接相关的细胞应激相关基因。因此，需要对成年斑马鱼进行全面的基因表达分析，以建立一个可行的ALD模型。此外，由于高于0.5%的血液乙醇浓度对人类是致命的，1%的乙醇治疗来代表慢性ALD可能并不理想。为了概括人类ALD的状况，我们测试了低剂量乙醇，可以诱导人中毒状态。在这项研究中，我们探讨了低剂量的乙醇（0.2%v/v）是否能再现乙醇诱导的肝损伤和ALD患者的相关代谢变化，如血糖和中性脂质水平的升高。重要的是，0.2%乙醇接近醉酒的人的血液乙醇浓度。为了评估这种代谢变化和肝脏损伤，我们测量了成年斑马鱼4周乙醇暴露后血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、葡萄糖和三酰甘油水平以及肝脏的组织学分析。此外，通过定量rt-PCR对与肝脏炎症、细胞死亡、纤维化、脂质和葡萄糖代谢相关的基因进行基因表达分析。此外，为了确定导致乙醇诱导的肝损伤的两个主要的应激信号通路，我们评估了与氧化应激和内质网（ER）应激相关的多个基因。

 

材料和方法：将两组20只野生型雄性斑马鱼（8月龄）饲养于含8 L水的玻璃鱼缸中，加入或不加入0.2%乙醇（V/V）饲养4周。每天早晨更换有/无乙醇的淡水，以降低乙醇浓度，乙醇浓度受鱼类代谢和自然蒸发的影响。我们每天喂两次普通食物（10毫克/鱼/餐，可在10分钟内可以完全食用的测试量）。

 

H&E染色：尸体在4°C的温度下，在4%多聚甲醛中固定一夜至两天。固定的样品被嵌入1.2%琼脂糖/5%蔗糖中，在4°C的温度下在30%蔗糖中饱和1至2天。用液氮冷冻固定块。制备10um切片。

 

苦味酸天狼星红染色：肝脏在4°C的温度下在4%多聚甲醛中固定一夜至两天。固定的样本被石蜡包埋并切片。对于苦味酸红染色，切片在二甲苯中脱石蜡，在蒸馏水中水合。载玻片与0.1%小天狼星红和快绿FCF溶液孵育1 h，并用酸化水（0.5%乙酸）冲洗。切片在二甲苯中清理，并用维克塔蒙特永久性介质固定。

 

油红O（ORO）染色：对横切面幼虫进行ORO染色，将10μm厚冰冻切片在室温下干燥5min。滴入150μl的ORO工作液（5%ORO加入60%异丙醇）于载玻片上染色30s，用蒸馏水冲洗载玻片，用75%甘油固定。

 

血液制备与生化分析：用肝素化的针头进行微创采血获得斑马鱼的血液。采血部位是在背主动脉区域沿体轴和肛门后部。饲养后20 h采成年斑马鱼血，用PBS按1:10稀释。三条鱼的平均血容量（平均体重=0.6 g）为25μl。使用Contour Next血糖测试条，用Bayer Contour Next糖尿病EZ仪测量血糖水平。在2000×g下用冷冻离心机离心分离血浆15 min。.将10μl血浆转移至96孔板，并使用基于微孔板的alt活性测定试剂盒测定alt。使用 INFINITY?甘油三酯液体稳定试剂测量稀释血浆中的甘油三酯（TG）。三条未乙醇暴露的对照组鱼和乙醇暴露的鱼在禁食一晚后摘取肝脏。肝组织匀浆缓冲液（250 mM蔗糖，25 mM KCl，0.5 mM EDTA，50 mMTris HCl，pH值7.4）中用1X蛋白酶和磷酸酶抑制剂用超声法匀浆。我们收集了裂解液，并使用Pierce?BCA蛋白质分析测定了蛋白质浓度.。在分析之前将裂解物保存在-80°C。根据制造商的协议，使用甘油三酯试剂测量肝脏TG。

 

细胞内活性氧的测定：用OXISCEAD测定细胞内ROS。收集裂解物（1 mg/ml），立即进行ROS/RNS测定。在480EX/530μEm BMG LabTeaCalooStAR（德国）中检测到过氧化物荧光二氯荧光素（DCF）的荧光强度，该荧光强度由非荧光前体二氯二氢荧光素（DCFH）形成。

 

测量GSH和GSSG水平：采用酶循环法定量测定肝脏裂解液中GSH和GSSG的含量。用磺基水杨酸沉淀对照饲料和富含PA饲料的成人肝脏提取物中的蛋白质，然后将上清液分成两个管。对于还原GSH，上清液用硫醇荧光探针IV孵育，并在400Ex/465Em下测量荧光强度。对于总GSH（GSH+GSSG），上清液经三乙醇胺中和后，与还原体系（含NADPH和谷胱甘肽还原酶）在37℃孵育20 min。

 

结果：低剂量乙醇诱导成年斑马鱼肝损伤及轻度纤维化：我们检测了低剂量乙醇治疗是否能诱导成年斑马鱼肝损伤。三组14月龄的野生型斑马鱼被隔离在一个容量为10升的玻璃罐中。对照组在一个隔离的水箱中饲养，水箱中有来自主要鱼类设施的系统水。诱导组在含0.2%乙醇（v/v）的水中饲养。每隔一天更换一次乙醇处理过的水，为期4周。组织学分析显示，0.2%乙醇处理的鱼中，出现气球状肝细胞积聚，轻度纤维化。此外，血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）活性测定显示，与未经治疗的对照组相比，乙醇治疗组出现肝损伤。此外，使用qPCR对炎症、细胞死亡、肝损伤和纤维化的基因表达分析显示，与未经治疗的兄弟姐妹相比，乙醇治疗组肝脏中的受试基因显著升高，支持慢性乙醇治疗后血清alt升高。

 

低剂量慢性乙醇诱导成年斑马鱼高血糖、高血脂：长期饮酒引起高血糖和高甘油三酯血症。我们测试了成年斑马鱼的低剂量慢性乙醇诱导是否能重现人类观察到的症状。用肝素包被玻璃移液针从斑马鱼躯干背主动脉采集血样。血液乙醇含量测定结果显示，0.2%（v/v）乙醇暴露后1天和4周的血液乙醇浓度分别为0.165%和0.175%。我们发现0.2%乙醇治疗组的血糖水平升高（比未治疗组高1.3倍）。此外，我们发现在0.2%乙醇处理后，与未处理的对照组相比，三酰甘油水平显著增加（2.2倍）。因此，成年斑马鱼的低剂量慢性乙醇治疗再现了乙醇性肝病患者的基本代谢变化，如高血糖和高血脂。

 

乙醇对斑马鱼肝脏脂质代谢和脂肪变性的影响：为了研究慢性乙醇处理对成年斑马鱼肝脏脂质代谢的影响，我们用qPCR检测了脂质代谢相关基因的mRNA表达。我们发现产脂转录因子的基因显著增加，包括固醇调节元件结合转录因子1（srebp1）、srebp2和CCAAT增强结合蛋白α（cebpa）。在0.2%乙醇条件下，参与脂肪酸合成的基因显著增加。乙醇处理后，乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A产生棕榈酸的（acc1）脂肪酸合成酶（fasn）表达增加，催化脂肪酸和甘油二酯形成甘油三酯的甘油三酯酰基转移酶2（dgat2）表达升高。我们还研究了肝脏脂肪摄取相关基因的表达。此外，我们还发现乙醇处理后低密度脂蛋白受体（ldlr）和脂蛋白脂肪酶（lpl）基因表达升高，提示乙醇诱导的肝脏脂质摄取增加。此外，乙醇诱导的肝脂肪变性通过油红o染色和肝内三酰甘油酯的定量测定得到证实。我们发现在0.1%乙醇处理条件下总甘油三酯增加2倍，在0.2%乙醇处理条件下肝脏总甘油三酯增加3倍。因此，成年斑马鱼的低剂量慢性乙醇治疗可使ALD的脂质代谢和脂肪变性表型增加。

 

乙醇处理增加与超氧物形成和氧化应激反应相关的基因转录：众所周知，慢性乙醇消耗增加肝脏中活性氧（ROS）和ROS介导的氧化应激，可能是导致肝损伤的主要应力。为了解决慢性乙醇治疗是否能够诱导斑马鱼肝脏中的氧化应激，我们分析了直接与超氧化物生成和氧化应激反应相关的基因的mRNA表达。我们发现，乙醇处理显著增加NADPH oxidases（NOX1、NOX2和NOX5）的表达，负责产生超氧化物，而降低NOX4，负责肝脏中的碱性过氧化氢的产生。我们推测，斑马鱼中的慢性乙醇治疗可能提高肝脏中的超氧化物水平。肝脏中的超氧积累可引起线粒体超氧化物歧化酶（SOD2）mRNA表达水平升高。SOD2表达的增加可能导致过氧化氢的积累，从而导致肝脏中氧化应激的增加。.因为氧化应激增加了与氧化应激反应相关的基因的转录激活，我们分析了两种主要的细胞氧化还原反应系统：谷胱甘肽系统和硫氧还蛋白系统。乙醇处理后谷胱甘肽还原酶（GSR）、谷胱甘肽S转移酶PI 1/2（GSTP1/2）、谷胱甘肽过氧化物酶1A/4A（GPX1A、GPX4A）表达均显著升高。此外，在乙醇处理后，我们检测到硫氧还蛋白4（PRDX4）和硫氧还蛋白样1/4（TXNL1，TXNL4）在硫氧还蛋白系统中的转录激活。活性氧定量结果显示乙醇可升高肝脏中的活性氧。此外，乙醇暴露后GSH显著降低，GSH/GSSG比值升高，提示氧化应激可能在成年斑马鱼肝脏发病中起重要作用。

 

结论：在低剂量慢性乙醇暴露下，成年斑马鱼能够很好地再现ALD患者的病理、代谢和应激反应。因此，我们的成年斑马鱼ALD模型可以作为研究人类慢性肝病的另一种动物模型。