1.材料和方法

(1)试验猪  试验猪群来自中国农业科学院畜牧研究所WZSP保种场，采集的F13～F16耳组织样用液氮保存。

(2)引物序列  所用引物序列从中国农业大学姜盛花硕士毕业论文《微卫星DNA标记对8个中外猪群体遗传结构的研究》所设计的18对中选取9对作为本试验的微卫星引物，从上海生工订购，如表1-13。

2.试验方法  将采集的耳组织用灭菌剪刀剪碎，采用常规分子遗传学方法进行研究，即：用常规酚氯仿抽提法提取DNA，用分光光度计检测其浓度及纯度，然后进行PCR扩增，扩增产物在2％的聚丙烯酰胺凝胶稳压120V电泳12～16h，银染显带，干胶保存。判断基因型，带型缺失或模糊的记为0，进行基因频率的计算。用GENEPOP、DISPAN、MICROSAT等软件分析位点平均多态信息含量、有效等位基因数和杂合度等。猪耳组织DNA的提取、DNA浓度和纯度的分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测测定、PCR扩增操作程序、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行微卫星分析、硝酸银染色方法、聚丙烯酰胺凝胶电泳技术路线、主要实验仪器、所需溶液及其配制等具体方法从略。

3.结果

(1)基因组DNA的提取猪耳组织样中提取的DNA用0.8％琼脂糖凝胶电泳分析，然后用紫外凝胶成像仪观察，部分结果见图1-12。从图中可看到有些基因组DNA已降解，但不影响微卫星引物的PCR扩增。

(2)微卫星DNA的PCR扩增对9个微卫星DNA位点分别进行PCR扩增，并用2％琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果见图1-13～图1-21。

(3)研究结果  分别如表1-14～表1-17所示。

(4)讨论

①基因纯合率：基因纯合率是每个个体基因位点纯合位点占总检测位点的比率。近交的结果使基因趋于纯合。因此，平均基因纯合率可以在很大程度上代表一个群体的近交程度。本实验中WZSP实验用近交系9个微卫星位点的平均基因纯合率为72.62％，表明WZSP实验用近交系的近交程度很高，为培育SPF实验用小型猪提供了有利的科学依据。

②WZSP群体内的遗传变异：微卫星由两或三核苷酸重复序列所构成的核心部分和两端的侧翼序列组成。侧翼序列使微卫星特异地定位于基因组某一位置，核心部分碱基重复数目的不同则是形成微卫星多态性的基础。微卫星具有多态性高、共显性标记的特点。其杂合度和多态信息含量(PIC)都是表示群体内遗传变异大小的测度。PIC及杂合度大说明群体内基因型一致性差，遗传变异大；反之，PIC及杂合度小则说明群体遗传变异性小。本试验选取的微卫星基因座是参照中国农业大学姜盛花硕士毕业论文《微卫星DNA标记对8个中外猪群体遗传结构的研究》中的18个微卫星引物中选取不同染色体上具有多态性的9个。由表1-14知，WZSP在9个微卫星位点的平均等位基因数仅为2.11，杂合度和多态信息含量分别是0.3849和0.3270，与其他猪种相比明显较低。Van Zeveren等用7个微卫星座位研究4个比利时猪种的平均杂合度在0.54～0.67；Dimoski等用18个微卫星座位测得约克夏、大白猪(英系约克夏)的平均杂合度分别为0.53和0.60；樊斌等用27个微卫星座位测得湖北省3个主要地方猪种通城猪、清平猪和阳新猪的平均杂合度和平均PIC分别为0.7489、0.6987、0.6273和0.7433、0.6839、0.6094。由此可见，WZSP群体的基因多态性低，遗传变异程度最低，特别是在SW2409位点与80070位点达到了完全纯合，说明该群体具有一定的遗传稳定性，已成为一个稳定的遗传群体。这种结果与WZSP是高度近亲繁殖形成的近交系的事实相符。

③WZSP三个世代微卫星基因座的杂合度与遗传纯合度：由于微卫星位点的特性，使它在亲子鉴定、胚胎移植、混合受精、亲缘关系分析和品种遗传纯度分析上十分重要。由表1-15知，9个微卫星基因座杂合度和多态信息含量在wZSP F14、F15、F16三个世代均小于0.5且呈现递减性，即H14≥H15≥H16和PIC14≥PIC15≥PIC16。由此可见，WZSP的近交程度较高，随着近交代数的上升，群体的遗传变异性降低。这说明WZSP经近交培育后，群体基因型趋于纯合；从而导致了遗传基因多样性的低水平。

④WZSP三个家系微卫星基因座的杂合度与遗传纯合度：家系Ⅰ F15的平均杂合度(H)及平均多态信息含量(PIC)分别为0.2934和0.2227，在SW1377、S0070、SW2409三个微卫星位点基因完全纯合。现已获得F17个体。家系ⅢF15平均杂合度(H)及平均多态信息含量(PIC)分别为0.3005和0.2408，且仅在S0070、SW2409两个位点完全纯合。家系ⅡF15的平均杂合度(H)及平均多态信息含量(PIC)分别为0.2075和0.1588，其值小于0.25，而且除了在SW2409位点与S0036位点达到了完全纯合外，在微卫星位点SW0070、SW1377、SW225也达到了完全纯合，即9个微卫星位点中的5个达到了完全纯合，即该家系的基因纯合度及近交程度相当高。这说明WZSP经近交培育后，由于自然的近交分化，群体中不断淘汰不利基因，纯化有利基因，使群体基因型趋于纯合；并且在长期的封闭繁殖中没有外来血缘加入，从而导致了遗传基因多样性的低水平。这为特有资源在人类比较医学研究、实验动物模型构建、基因敲除、人源化器官移植等领域的开发利用奠定了基础。