1.选用微卫星标记的特点  为了WZSP近交系培育提供更为准确的科学依据，2005～2006年对WZSP近交系进行了第二次大规模的微卫星标记检测研究，其选用的微卫星标记更具有通用性、代表性多态性和有效性。

(1)通用性  属于美国猪基因组协作计划推荐的第11组用于遗传多样性和亲缘鉴定研究的微卫星标记。

(2)代表性  选择的21个位点在猪单倍体中的每条染色体中都有，分布广，且1号和3号染色体的两个标记分布于染色体的不同臂。

(3)多态性  这些引物在普通猪群的多态性都很好，等位基因数最少的为4。

(4)有效性  其中的14对标记S0155、SW240、SW72、SW0227、S0005、S0228、S0101、S0355、SW911、SW951、S0386、S0090、SW769、SW857，被用来进行奥地利猪种(长白猪、皮特兰猪和大白猪)的亲子鉴定，其中10对引物进行多重PCR的鉴定结果的叮靠性都在99％以上。

研究所用21对微卫星标记，各座位的染色体位置、等位基因数、荧光标记和扩增条件见表1-18。

2.研究结果

(1)等位基因数与杂合率  三个小型猪品种21个座位等位基因数范围分别为：贵州小型猪(GZMP)2～9个，广西巴马小型猪(GXMP)2～5个，WZSP近交系2～5个，平均等位基因数依次为5.2、3.3和3.4个。21个座位的杂合率分别为：贵州小型猪0.279～1.000，广西巴马小型猪0.104～0.980，五指山猪近交系三家系混合0.0～0.974，平均等位基因数依次为0.543、0.517和0.448，详见表1-19和图1-22。从图1-22中可以看出WZSP近交系低杂合率的位点数最多。将五指山猪近交系三个系个体按系划分后，21个座位的平均等位基因数及杂合率依次分别为：Ⅰ系2.7和0.446，Ⅱ系2.5和0.439，Ⅲ系2.8和0.457，三个品系含有1～4等位的座位数分布见图1-23。

(2)微卫星各座位的优势等位基因  21个座位在三个小型猪品种中各有优势等位基因，且频率不同。其中11个座位的优势等位基因在品种间的差异巨大，品种特有的等位基因包括见1-20深色背景的片段A栏，品种特有等位基因中具有较高频率的片段见P栏深色背景。从表1-20中A栏和P栏组合可以得到用于三个小型猪品种准确分辨的座位有SW24、SW951、S0005、S0101、SW769、S0355、SW902、SW72、S0218、S0090、CGA。3个小型猪品种中特有等位基因共96个，其中贵州小型猪有49个，WZSP近交系有22个，广西巴马小型猪有25个，这些片段可以用作三个小型猪品种个体的遗传鉴定。

(六)SNP检测研究

1. SNP位点选择原则  能分辨任意两个近交系，各SNP在染色体上要具有足够大的距离，使用最少的SNP就能达到区分所有近交系的目的，能快速、自动处理样品及处理数据。

2.三个小型猪品种基因频率  三个小型猪品种10个SNP位点[PNAS-4(MspI)、PNAS-4(HinI)、Pnas-4(TasI)、Pnas-4(StyI)、HUMMLC2B(HinlI)、HUMMLC2B(MspI)、 HUMMLC2B(BglI)、Calsarcinl(BseLI)、Calsarcin2(BseNI)、ADSSL(BspT)]基因型频率见表1-21；基因频率见表1-22；检测个体数、杂合子数和杂合率见表1-23。在所检测的9个SNP位点中，WZSP近交系有6个位点纯合，广西巴马小型猪和贵州小型猪各有2个位点纯合。表1-24为SNP测试结果之一。

(七)Y染色体特异性分子遗传标记研究其结果列表1-25和图1-24、图1-25。

三个小型猪品种中，GXMP 2头公猪SRY基因的序列完全一致，GZMP的8头公猪SRY基因序列间相似性系数在99.3～99.9，平均为99.62，WZMP的5头公猪SRY基因序列间相似性系数在99.7～100，平均为99.83。三个品种间，GXMP与GZMP间平均相似性系数为99.76，GXMP与WZSP间平均相似性系数为99.78，GXMP与WZSP间平均相似性系数为99.55。从SRY基因序列间相似性可以看出除GXMP2头公猪完全一致外，WZSP个体间相似性最大。

(八)线粒体DNA标记

其结果如表1-26和图1-26所示。

三个小型猪品种中，GXMP个体线粒体序列间的相似性系数在98.9～99.8，平均为99.33，GZMP个体线粒体序列间的相似性系数在99.1～99.8，平均为99.39，WZMP个体线粒体序列间的相似性系数在99.5～100之间，平均为99.75。三个品种间，GXMP与GZMP间平均相似性系数为99.26，GXMP与WZSP间平均相似性系数为99.1，GXMP与WZSP间平均相似性系数为99.17。从线粒体基因序列间相似性可以看出，WZSP个体间相似性最大，达到99.75。这与WZSP经过近交繁育，其遗传趋于稳定、变异性最小取得一致性的结果，同样为其近交繁育体系的建立提供了科学的理论依据。

微卫星DNA标记、SRY基因、线粒体DNA比对等研究结果，从分子遗传学深层证实了WZSP近交培育的可靠性、遗传稳定性，为其近交繁育体系的建立提供了科学的理论依据，并揭示了该近交系遗传稳定性的分子遗传机理。

(九)皮肤移植检测试验

皮肤移植试验是检测和判断近交系实验动物最有说服力的证据之一。为此，同解放军304医院合作开展了实验用WZSP近交系皮肤移植试验，选用F13同窝2头7月龄母猪，于肩胛后方相互交叉移植面积为5cm×5cm，皮厚1.1cm。第一头取皮太厚，严重损害皮下组织，第二头取皮比较理想。分别于术后第7和14、21天观察。发现第二头生长良好。未发现排斥反应。表明近交的可靠性和稳定性。

F14个体间进行的皮肤交叉移植试验未见急性排斥反应发生。证实实验用WZSP近交繁育已达到相当高的水平。