脑震荡(cerebral concussion, CC)是轻型脑损伤。脑震荡后综合征(post-concussion syn drome, PCS)是常见的脑损伤后遗症，在其纷繁的临床表现中，认知、学习、记忆改变是最常见的损害表现之一。本节重点介绍在国家自然科学基金项目资助下建立起来的脑震荡大鼠不同认知行为改变的实验模型方法。

一、实验目的

利用八臂迷宫、Morris水迷宫检测脑震荡大鼠顺行性与逆行性学习、记忆行为变化。

二、实验材料与方法

(一)八臂迷宫

1.实验材料与仪器

(1)健康成年SD大鼠。

(2)带监控摄像的八臂迷宫。

(3)单摆式闭合性大鼠脑损伤模型复制仪。

(4)75％乙醇。

2.实验动物、脑震荡大鼠模型复制

(1)实验动物：健康成年SD大鼠，体重(280±30)g，完全雄性或雌雄各半。动物于实验前3d运到实验室，在安静环境下饲养，模型复制前给以充足的食物和水。

(2)脑震荡大鼠模型复制与判断标准：打击前先记录大鼠每分钟的呼吸频率，测试大鼠的角膜反射、疼痛反射、外耳道刺激反应、翻正反射，并记录大鼠的精神运动情况及有无竖尾、大小便失禁等。将完全清醒的大鼠固定在金属单摆式闭合性脑损伤模型复制仪实验台上(图11-1)，头上昂45°，摆锤上举使角度达95°～105°，摆锤自由下落，撞击在大鼠额顶部。分别记录打击后1min、3min、5min、10min和30min大鼠的呼吸频率，测试上述各种反射或反映情况。

大鼠脑震荡判断标准：①撞击后即刻出现一过性呼吸暂停，但不超过20s；②出现短暂的角膜反射、针刺疼痛反应、翻正反射、外耳道刺激反应消失，但不超过3min；③意识恢复后无运动障碍和反射异常；④无颅内出血；⑤全脑肉眼无明显损伤改变。符合上述标准者为单纯性脑震荡(pure cerebral concussion, PCC)，超出上述标准者为复杂性脑震荡(complicated cerebral concussion, CCC)。

3.八臂迷宫实验方法与操作步骤

(1)八臂迷宫装置：为一个等角“米”字形八臂，由光滑塑料板制成。将其置于距地面20cm高处，中央有一公共平台，直径为20cm，并通过透明可控小门与各臂相连。八臂每臂长50cm、宽10cm、高30cm。每臂距末端2cm有一直径为2cm的食物盒，盒内放置食物(葵花籽)者称为有食物臂。无食物者称为无食物臂。迷宫四周设置有不同形状的参照物(图11-2)。

(2)环境适应训练：伤前2d，在八臂末端食物盒内均放置食物，将大鼠放入中央平台，打开小门，让其在迷宫内自由觅食5min。动物在每天迷宫实验前12h内进行进食量控制，即只能饮水不能进食，排除动物饱食后的惰性干扰。

(3)脑震荡后参考记忆与工作记忆实验操作程序：动物造模损伤后第1天，通过随机抽样确定每个动物在八臂迷宫测试中固定放置食物的4个有食物臂；一旦确定，整个实验周期都保持不变，其余4个臂为无食物臂。实验开始，将大鼠放入中央平台，打开小门，让大鼠在迷宫内自由觅食5min。以大鼠后肢完全通过八臂的小门为一次进入。每天定时在上午进行测试，连续测试实验设计所需要的天数。每次测试完后，使用75％的乙醇擦拭八臂内板，以消除实验大鼠遗留气味的干扰。每次实验。记录大鼠下列实验参数：入臂总数与摄食量；进入有食物臂的次数，摄取食物后重复进入有食物臂的次数；首次与重复进入无食物臂的次数。

(4)实验参数的意义：大鼠每天进入所有臂的次数，为其精神运动状态指标；大鼠每天进入有食物臂的次数，为其参考记忆指标；每天首次进入无食物臂的次数，为参考记忆错误指标：大鼠每天重复进入无食物臂的次数与摄取食物后重复进入有食物臂的次数之和，为其工作记忆错误指标。

4.八臂迷宫实验操作中各步注意事项

(1)每天实验前12h内严格控制进食是本实验成功的关键。脑震荡后，大鼠由于脑损伤会减少进食量。需每天称体重。关注大鼠体重变化。

(2)实验中用自然光照明，早8点开始实验较为合适，有文献指出暗视野更利于大鼠活动，本实验中并未发现自然光与暗光有不同。

(3)保持实验环境安静，维持实验室恒温恒湿，如无空调，夏秋季实验效果更好。

(二)Morris水迷宫(MWM)

1.实验材料  Morris水迷宫：水温保持(26±1)℃，实验室内的灯光亮度恒定。迷宫为一圆形水池。直径180cm。池壁上标有东、南、西、北4个入水点，将水池等分为4个象限，在东南方向(第1象限内)离池壁33cm处，有一恒定平台，该平台顶部平面潜伏于水面下，距水平面2cm，见图11-3。按顺时针方向依次为第Ⅱ象限、第Ⅲ象限、第Ⅳ象限。迷宫周围对应各入水点上方同一高度均放置一个形状不同的参照物。迷宫正上方放置带有显示系统的摄像机，行为学测试期间迷宫外参照物个数、高度、颜色和形状均保持不变。

2.实验程序

1)脑震荡大鼠顺行性空间学习行为测试：模型复制成功后第1天(24h)开始，对各实验组大鼠进行连续7天的Morris水迷宫行为学测试，包括第1～5天的水下平台实验，第6、7天的水上平台实验及第7天的无平台实验。

(1)水下平台实验：伤后第1～5天进行。将大鼠背侧面向池壁随机按4个方向放入水中，以120s为限，记录大鼠从入水至爬上平台的时间(逃避潜伏期)，超过120s未能爬上平台者记录为120s，并协助其找到平台。到达平台的大鼠使其在平台上停留30s，然后放回温箱休息4min，开始另一轮实验，直至4个象限都测试完毕。

(2)水上平台实验：第6、7天进行。将实验平台升高4cm暴露于水面上，并将平台边缘标记成白色，用于加强大鼠的学习记忆能力。将大鼠背侧面向池壁随机按4个方向放入水中，以120s为限，记录大鼠逃避潜伏期，超过120s未能爬上平台者记录为120s，并协助其找到平台。到达平台的大鼠使其在平台上停留30s，然后放回温箱休息4min，开始另一轮实验，直至4个象限都测试完毕。

(3)无平台实验：第7天撤去平台后进行实验，共测试两次，来了解大鼠的参照记忆能力和记忆的保持情况。本实验在第2天水下平台实验完成4min后立即实施。将大鼠从远离平台方向的位置投入水中(即北方和西方)，以60s为限分别记录大鼠在4个象限的停留时间。两次实验间期的休息时间仍为4min。

2)脑震荡大鼠逆行性遗忘行为测试：逆行性遗忘是脑震荡的重要行为学特征。

(1)习惯化。所有实验动物在开始训练前一天均放入Morris水迷宫中3min以达到习惯化。

(2)伤前学习、记忆训练。连续在伤前3d的相同时间，将已完成习惯化的动物分别进行隐匿平台学习训练。隐匿平台隐藏于水下2cm。放置在西南方向恒定位置。实验室内的灯光亮度恒定。先将动物放于隐匿平台上30s作为提示，然后按随机顺序将动物分别从4个象限让其面朝池壁入水，监控系统同时记录大鼠游泳轨迹和运动时间，并以120s为时限，记录动物从入水到爬上隐匿平台的时间(逃避潜伏期)，超过120s未爬上者记为120s，动物爬上隐匿平台后让其在平台上停留30s，然后休息4min(超过120s未能爬上平台者。人为帮助其爬上平台。让其在平台上停留30s后休息4min)。然后进行下一个象限的检测。直到4个象限全部测试完毕。

每个受试动物在完成上述实验后休息4min，进行无平台实验。

(3)模型复制。于实验第4天上午，在完成隐匿平台实验后休息4min进行无平台探索实验，以获得大鼠第4天上午记忆状况的伤前数据即baseline。无平台探索实验(probe test)方法：撤去平台，将动物分别从距原来放置平台最远的两个象限入水，以60s为时限，记录动物在每个象限所停留的时间，取其平均值。

在第4天下午，对已完成上述预训练与测试并编号的大鼠，通过随机方法先分出对照组 C，其余动物进行CC模型复制，按损伤分类标准分别纳入PCC组或CCC组。每组8只动物。伤后1～7d的MWM隐匿平台、可见平台和无平台探索实验同前。

(三)实验操作中各步注意事项

(1)注意保持实验室恒温恒湿，如无空调，夏秋季实验效果更好。

(2)实验过程中保持安静，以免脑损伤后大鼠惊厥。

(3)大鼠出水后迅速擦干，保温。

三、实验结果

(一)八臂迷宫实验

通过八臂迷宫实验，可以获取大鼠在脑震荡损伤后的精神活动状态、摄食量变化情况、长时参考记忆与短时工作记忆的受损变化状况。

1.脑震荡大鼠精神活动状态与摄食量变化  大鼠脑损伤后，常常出现一个精神活动度下降与食欲低下的阶段。通过每天测试损伤大鼠进入所有臂的总次数与食物摄取量即可客观地反映出这两个病理生理现象的动态变化过程(图11-4和图11-5)。

与正常组比，PCC大鼠伤后7d进入臂的总次数均明显减少，中后期逐渐恢复正常，但始终低于正常组；其中PCC组大鼠在伤后1～7d和13d有统计学意义(P<0.05)。

与正常组相比，PCC大鼠在伤后11d的食物摄取量均明显下降，随后逐渐恢复正常，但始终低于正常组；其中PCC组大鼠在伤后第1～11天均有统计学意义(P<0.05)。

2.脑震荡大鼠参考记忆动态变化  八臂迷宫实验中的参考记忆属于长时程记忆，它由实验动物每天选择进入有食物臂的次数表示或每天首次进入无食物臂作为参考记忆错误表示。受试大鼠参考八臂迷宫四周形状有差异的提示物，通过反复的学习强化记忆，记住有食物的4个臂方位，越来越准确地进入有食物臂找到食物，完成任务获得食物奖励(图11-6)。

与正常组比较，PCC大鼠伤后7d选择进入有食物臂的次数明显减少。随后逐渐恢复正常，但仍然低于正常组；其中PCC组在伤后1～7d有统计学意义(P<0.05)。

3.脑震荡大鼠工作记忆错误变化  八臂迷宫实验中的工作记忆属于短时程记忆。常以大鼠重复进入无食物臂与摄食后重复进入有食物臂的次数来表示(图11-7)。

随着大鼠学习天数的积累，正常组大鼠重复进入无食物臂的次数明显下降，而PCC组在伤后1周因精神活动度低，没能反映出工作记忆状况。随着精神活动度恢复，持续出现较高的工作记忆错误；与正常组相比，PCC组在伤后1～6d、10～23d有统计学意义(P<0.05)。

(二)Morris水迷宫

MWM是目前世界上通用的测试实验动物空间认知行为变化的有效方法。在脑损伤研究领域也被广泛运用，但运用于脑震荡大鼠的顺行性遗忘研究与逆行性遗忘研究尚不多见。

1.脑震荡大鼠顺行性学习、记忆改变

1)水下平台实验：水下平台实验是检测大鼠空间学习认知行为的重要实验。正常大鼠通过1～3d的学习，很快就能够掌握找到水下隐匿平台位置的方法，其逃避潜伏期(即找到平台的时间)表现为1～5d迅速下降，然后趋于平稳；而PCC组大鼠的逃避潜伏期在损伤后1～4d明显延长，其损伤后1～6d学习认知能力的提升明显滞后，随后趋于正常。这也说明了属于轻型脑损伤的PCC具有较快恢复的特性(图11-8)。

与正常对照组比较，PCC组大鼠逃避潜伏期在伤后1～4d明显延长，具有统计学意义。    2)水上平台实验：在水下平台实验结束后进行连续2d的水上平台实验，其目的在于进一步强化大鼠的空间记忆能力，PCC组与对照组比较，常没有显著差异(表11-1)。

3)无平台实验：在无平台实验中，重点是检测受试动物的记忆提取功能。PCC组大鼠在损伤后第16天，在原平台Ⅰ象限停留徘徊的时间显著增加，但与正常组相比没有明显差异(表11-2)。

    2.脑震荡大鼠顺行性学习、记忆改变逆行性遗忘是遭受脑震荡损伤或使用麻醉药物的动物，对其损伤或用药前一段时间所经历的事件不能回忆起来的遗忘现象。它是脑震荡的典型临床症状。大鼠经过数天的MWM空间学习认知后，建立了良好的空间记忆能力，在给予其脑震荡造模后，就会立即出现数天的逆行性遗忘(图11-9和图11-10)。

四、结果分析

(一)有关八臂迷宫实验

通过对PCC大鼠伤后24d的空间参考记忆与工作记忆进行动态比较研究发现，CC大鼠在伤后8d内，精神运动状态与摄食功能明显处于抑制状态，9d以后逐渐恢复正常。上述精神运动状态与摄食功能行为的伤后抑制状态，一方面再次证实脑震荡后大脑的广泛区域受损，甚至觅食相关中枢也受到损伤；同时也提示在脑震荡大鼠损伤后前8d，由于其精神运动状态与摄食功能的抑制。可不同程度地干扰受损大鼠学习认知功能的检测结果，至损伤11d后才能较好地显示出脑震荡大鼠参考记忆与工作记忆的异常改变，故脑震荡大鼠的八臂迷宫实验需要有足够的测试周期。

目前认为，空间参考记忆主要与大脑的海马有关，工作记忆与大脑的前额叶有关，摄食功能与下丘脑觅食中枢有关，精神运动状态代表了大鼠的注意与决策功能，它涉及大脑顶叶、额叶、上丘及丘脑等更为广泛的区域。因此，八臂迷宫是评价脑震荡大鼠中枢神经系统功能损伤程度较理想的实验方法。

(二)有关MWM实验

通过对脑震荡大鼠进行伤后14d的顺行性空间学习认知实验与9d的逆行性遗忘实验研究发现，在顺行性学习认知方面，PCC大鼠在伤后1～4d找到水下平台的时间明显延迟，说明受损大鼠早期与记忆过程相关的前3个环节即“学习、巩固、存储”出了问题；至于在伤后第16天的无平台探测实验中。其记忆过程的第4个“提取”环节没有表现出明显异常，这说明PCC大鼠的顺行性学习认知异常是可以较快恢复的。笔者实验室先前较短测试周期的MWM实验结果也显示。PCC大鼠在损伤后第8天的无平台探测实验中也无显著性差异。    在逆行性遗忘方面。大鼠在损伤之前经过4d的学习训练，建立了良好的空间记忆力，但脑震荡后，这种记忆力很快显著下降，其中PCC大鼠需要3d才能恢复，而CCC大鼠5d还没有恢复，由此得出损伤越重、逆行性遗忘恢复的时间越长的结论。此外，逆行性遗忘不仅涉及记忆的“学习、巩固、存储”环节，而且“提取”环节也同样受到了损害。

五、经验与体会

(1)八臂迷宫属于正性食物奖励实验，它需要受试动物的强烈觅食行为作为驱动力，通过禁食增加动物的食欲很重要。但脑损伤动物的觅食动机下降，精神运动状态受到抑制，所以适当控制脑震荡大鼠的摄食，防止其体重猛烈地下降，对保证实验成功很重要。

(2)在八臂迷宫实验中，只能让大鼠利用房间内既定提供的参考信息。这就需要实验室的4个墙壁完全一致、放置食物的小盒子统一，食物小盒内的食物不能放置太多。每次实验结束后须立刻用乙醇溶液擦拭每个臂的地板与侧板。

(3)每天在固定时间测试。操作轻柔，避免不必要的应激刺激。实验选在进食前进行，即实验结束就开始供食。实验室内灯光需恒定，最好选用日光灯，这样便于观察。

(4)Morris水迷宫是一种负性惩罚实验，受试大鼠因害怕被溺死而产生强烈的寻找救命平台行为，于是形成了空间参考记忆。对比食物驱动的八臂迷宫实验，动物在MWM中具有更大的逃离水环境的动机。而且不必禁食。

(5)MWM实验应当每天在固定时间进行测试。操作需轻柔，避免不必要的应激刺激。要注意动物的性别、品系、泳池尺寸和水温等多种因素对实验结果的影响。注意给动物保暖。当以游泳速度作为观察指标时，要考虑到动物的体重、年龄及骨骼肌发育状况等对游泳速度可能造成的影响。

(6)游泳对动物而言是一个较大的应激刺激，可引起神经内分泌的变化。这些变化可能对实验结果造成干扰。因此，必要时可将动物多次放入泳池或适当延长其游泳时间以增加动物对游泳的适应能力。

(7)当用实验染料搅浑泳池的水时，要定期换水以免水腐败变质。