一、实验目的

制备大鼠脊髓挫伤模型，研究脊髓损伤后大鼠行为学和形态学的变化。

二、实验原理

根据Allen建立的重物坠落致脊髓损伤的方法建立本实验动物模型，即采用一定质量的物体从某个高度自由落下，打击特定脊髓节段而致伤。这种模型比较接近人类脊髓损伤的病理生理特点及变化规律，为研究脊髓损伤后人类行为学和形态学的变化提供依据，对探索神经损伤后的再生和重建有很大帮助。

三、实验材料与方法

(一)实验材料

1.所需设备  打击仪(自制)、常规手术器械、手术台、照明灯等。

注意：手术器械在使用前应灭菌消毒备用。打击仪为自制仪器，调整到实验所需高度后，重物下降由开关控制。

2.所需试剂  3.6％水合氯醛，75％乙醇，碘伏，8U/ml青霉素钠，生理盐水，葡萄糖溶液。1％伊红溶液，苏木素，1％盐酸乙醇，4％多聚甲醛。

3.试剂配制

(1)3.6％水合氯醛溶液：称取0.36g的水合氯醛溶于10ml的蒸馏水中，混匀，现配现用。

(2)1％伊红溶液：称取伊红Y 1g，加少量蒸馏水溶解后，再滴加冰乙酸直至糨糊状。以滤纸过滤，将滤渣在烘箱中烤干后，以95％乙醇100ml溶解。

(3)苏木素染液：将苏木素(6g)溶于无水乙醇(100ml)，再将硫酸铝钾(150g)溶于蒸馏水(2000ml)，溶解后将甘油(900ml)倾入一起混合，最后加入冰乙酸(120ml)和碘酸钠(1.2g)。

(4)1％盐酸乙醇分化液：将1ml浓盐酸加入99ml 70％乙醇中即可。

(二)实验具体方法和操作步骤

1.实验动物及饲养环境  该动物模型采用SD大鼠，雌性，约3月龄，体重为(220±20)g。实验动物饲养室的温度为18～19℃，相对湿度为40％～70％，每小时换气次数为10～20次，噪声在60dB以下，每立方米空气中氨浓度在14mg以下，工作照度为150～300lx。每天喂料、喂水，垫料每周更换2～3次。

2.脊髓损伤

(1)大鼠麻醉与固定：大鼠腹腔注射3.6％水合氯醛麻醉，剂量为1ml/100g。3～5min后。大鼠出现站立不稳，疼痛反应弱或者消失。大鼠俯卧位固定于手术台上。

(2)脊髓损伤：常规备皮，消毒铺巾，以T8、T9为中心，取一背部正中切口，长1～1.5cm，逐层分离筋膜、肌肉，暴露T8～T10(第6～8胸椎)节段脊椎棘突，钝性分离T8、T10节段脊椎椎骨上的肌肉，咬骨钳咬除T8、T10节段棘突及椎板，暴露T10脊髓。选择10g金属棒在30mm处自由下落，打击T10神经节段。注意：打击前对金属棒进行消毒处理，并且打击后对脊髓损伤区进行清洗处理。脊髓损伤成功以鼠尾摆动和后肢回缩性扑动为标志。

(3)术后处理：打击完毕后，用消毒的手术缝合针线分别对肌肉、筋膜和皮肤进行缝合，消毒。腹腔注射2ml葡萄糖溶液，肌内注射1ml(8U/ml)青霉素。

(4)术后日常护理：术后1周内对伤口进行消毒处理，并肌内注射1ml(8U/ml)青霉素。每天3次帮助实验动物排尿，直至能够自主排尿。饲料和饮水正常供应。

3.脊髓损伤动物模型的评价  动物脊髓损伤后的功能评定包括运动功能评价、神经电生理评价和组织形态学评价。在本实验中采用运动功能评价和组织形态学评价。

行为学评分法(the Basso Beattie Bresnahan locomotor rating scale, BBB评分)：即将实验动物放于旷场中，观察其后肢在5min内的运动情况(见表2-1)。

组织形态学评价：在本实验中。设计脊髓损伤实验3d、5d、7d和9d组。即在脊髓损伤之后允许其存活3d、5d、7d和9d。通过心室灌注4℃ 4％多聚甲醛固定大鼠。固定后取大约1cm的脊髓段，常规石蜡包埋备用。运用HE染色观察脊髓损伤后形态的改变。将固定好的玻片放于显微镜下观察。

(三)实验操作中的注意事项

(1)动物模型：制作时尽量减少出血，术后注意防止伤口感染。

(2)行为学测试：在实验前，让大鼠在测试区内适应性活动，减少它对陌生环境的恐惧；观察时间为5min/只。评分实行双盲法，并且由3位熟练者进行。

四、获得的实验结果

 (一)BBB评分结果

BBB评分结果显示脊髓损伤后评分降低，结果如表14-1所示。

(二)形态学结果

脊髓损伤后通过HE染色，可以观察到损伤后不同时间病理状态的改变。

五、结果分析

大鼠脊髓挫伤模型能模拟人类脊髓损伤。通过构建动物模型，可以观察到脊髓损伤后 BBB评分降低，但在后期随着时间的延长，运动功能有部分恢复。同样，在形态学上也得到了相似的结果。

六、经验与体会

构建动物模型，需要使其损伤的部位和程度一致，否则会导致模型不一致。

动物模型不能完全代表最终的临床试验，在时间和空间上存在其局限性。因此，设计动物模型时应尽可能地接近临床，并能有效地代表临床疾病。