一、实验目的
缺血性脑卒中后的神经功能恢复比较困难,原因是成年哺乳动物中枢神经系统的可塑性比较弱,断离的轴索没有再生能力。Torre首次采用永久性结扎大鼠双侧颈总动脉制作出慢性脑缺血的动物模型。一般认为永久性结扎大鼠双侧颈总动脉在3周后即进入慢性脑缺血期。本节参照了Torre的方法,同时借鉴了范文辉制作血管性痴呆动物模型的经验,通过永久性结扎大鼠的双侧颈总动脉,制作出慢性脑缺血的Wistar大鼠动物模型,对脑缺血大鼠的行为进行测试,探讨该模型的制作方法与损伤后的行为学变化,以期对临床上慢性脑血管疾病的治疗研究提供帮助。
二、实验材料与方法
(一)实验动物与分组
动物选择及分组:取雄性、健康、7月龄、体重相似的Wistar大鼠[(350~400)±5]g 30只,随机分为3组,即缺血30d组10只,缺血120d组10只,对照组10只。动物自由饮食,室温22~25℃。
(二)实验方法
1.永久性结扎大鼠双侧颈总动脉 戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(1ml/kg),行颈前正中手术切口,钝性分离两侧肌肉,在手术显微镜下,于深面找到颈总动脉,分离其周围的神经后永久性完全结扎动脉,制作出慢性脑缺血的动物模型,对照组则未进行任何处理。术毕于缝合前在创口上滴庆大霉素,同时于四肢肌内注射庆大霉素以抗感染。
为避免大鼠因急性脑水肿而死,最好先结扎一侧动脉,间隔15min左右再结扎另一侧,此时整个脑的供血总量明显减少。采用激光多普勒血流仪监测局部脑血流,同侧局部脑血流下降到手术前的20%表明造模成功。由于存在个体差异,存活率仅56%,术毕将大鼠置于暖房。手术后第3天,剔除造模不成功的动物,即没有对侧前肢屈曲的动物。
2.行为观察 将对照组、慢性脑缺血30d组和慢性脑缺血120d组的大鼠(后两组分别在术后24~30d和114~120d)进行共7d的Morris水迷宫实验(将水迷宫分为4个象限,只在第3象限有平台),其中前5d进行定位航行实验以对大鼠进行学习能力的测试(随机从4个方向把大鼠放入水中,每只大鼠从入水到找到水下平台的时间即逃避潜伏期,平台低于水面2cm。如在120s内不能找到平台,则将它放到平台上30s,并记录为120s)。第6天进行水上平台实验是为了强化记忆(因大鼠能看见平台,故其数据不进行统计学分析)。第7天进行无平台的空间探索实验,以最终检测大鼠的学习和记忆能力(记录大鼠在各象限的时间。检测其对原有平台的第3象限是否有记忆,实验时间为60s)。采用电脑记录和人工记录相结合。
3.统计学处理 用统计软件包SPSS行单因素方差分析,以q检验进行组间比较及配对t检验进行同一只大鼠的左右两侧比较。
三、实验结果
(1)术后一般情况:在手术后3h内处于昏睡状态,翻正反射存在,醒后走路共济失调,出现转圈,第2天即能进食饮水,能卷尾行走,但不能奔跑,对外界刺激反应迟钝,少数大鼠出现眼睑下垂、微闭。7d左右上述症、状体征大部分消失,无明显运动障碍,但与对照组比较,对外界环境的刺激反应淡漠,尤以120d组明显。
(2)造模之后,所有缺血组动物都出现明显的运动障碍。这些神经症状可自发而缓慢地恢复。在脑卒中早期,各缺血组动物的神经功能恢复没有显著性差异。
(3)通过定位航行实验可以看出,缺血120d组的逃避潜伏期较其他两组显著延长(P<0.05)。而缺血30d和对照组无显著性差异(P>0.05)(图16-1)。
(4)空间探索实验:撤除平台后,在原有平台第3象限所停留的时间,缺血120d组最短,与对照组和30d组比较有显著性差异(P<0.05)(表16-1)。
四、结果分析
大鼠脑的血液供应与人基本一样。用其做脑缺血模型能较真实地模拟人体的病变。所以很多学者无论做急性还是慢性脑缺血模型都用大鼠。将大鼠永久性结扎双侧颈总动脉(2VO)后得到的脑缺血模型适合进行慢性研究。经证实,2VO后2.5h脑血流量减少25%~50%。1周后仍明显减少并可持续数月之久。2VO这种方法创伤大,死亡率高,其实质是以慢性低灌注引起脑缺血缺氧,最终使神经细胞功能障碍,学习和记忆力下降。本研究行为学检查发现,在定向航行实验中,缺血120d组的逃避潜伏期显著延长;在空间探索实验时,120d组在原平台象限停留时间较其他两组显著缩短,说明其学习与记忆能力均较对照组和30d组明显下降,这是因为大脑皮质是与学习和记忆有关的重要结构之一,2VO后引起的脑血流持续下降造成的损害影响了学习和记忆功能。