缺血性脑血管病(ICVD)是威胁人类健康与生存的主要疾病之一,是中老年人的常见病,具有发病率、死亡率、致残率、复发率高的特点,是目前重点防治的一种疾病。
一、实验目的
通过建立活体脑缺血-再灌注动物模型,模拟人类ICVD的病理过程,来系统研究脑缺血一再灌注损伤的发病机制及病理变化。以及评价各种有效干预措施。
二、实验原理
大脑中动脉(MCA)为临床上发生脑缺血损伤最常见的部位之一。故大脑中动脉阻塞(MCAO)模型被广泛用于局灶性脑缺血的研究。用血管内线栓阻断法制备大鼠 MCAO模型。已被脑血管病研究者广泛接受和采用。是研究局灶性脑缺血最常用的造模方法。该方法利用尼龙线栓从一侧颈总动脉或颈外动脉阻断MCA供血造成局灶性脑缺血,缺血一定时间后回撤线栓,缺血区可通过脑底动脉环由对侧的颈内动脉、椎基底动脉和脑动脉皮质支的侧支循环实现再灌注。目前实验室较多采用MCA阻断120min、0min及90min的短暂脑缺血-再灌注模型。大鼠MCAO模型改良Zea Longe法技术路径示意见图16-2。
三、实验材料与方法
(一)实验材料
1.实验动物 SD雄性大鼠,体重250~300g,清洁级。
2.所需手术材料 器械盘,3.6%水合氯醛,一次性5ml注射器,尼龙鱼线(直径0.26mm,日本产,按要求制好备用),备皮剪、小杂物盘、眼科直剪,眼科弯剪,眼科直镊,眼科弯镊,止血钳,持针器,玻璃分针,手术缝针,0号手术线,无菌棉签,碘伏,生理盐水等。
(二)MCAO模型制备的操作方法与步骤
1.线栓的制备 选用直径为0.26mm的钓鱼线,用锋利薄刀片将线身垂直截成5cm长的小段,用细砂纸打磨头端棱角,在体视镜下选出头端光滑钝圆、大小一致者。用记号笔在距线栓头端20mm处做一标记,将线栓浸泡消毒后晾干。术前置于无菌生理盐水中备用,线栓临用前浸蘸2.5×1000000U/L肝素钠。
2.术前动物准备 分笼饲养(室温20~23℃,湿度60%~70%),明暗光照12h:12h,适应性饲养1~2d,并按实验动物使用的3R原则给予人道关怀。术前12h禁食,自由饮水。
3.动物麻醉 以3.6%水合氯醛腹腔内注射麻醉(10ml/kg),注射器针头从腹部向头方向刺入腹腔,回抽针芯阻力较大、无回血、无胃肠道内容物时,缓慢推注。约10min后大鼠逐渐瘫软,反应淡漠,用手牵拉鼠尾无明显反抗时置仰卧位,固定上颌中切牙和四肢。实验过程中维持大鼠肛温在37℃左右,直到恢复活动。
4.手术步骤 手术按外科无菌原则操作。①备皮,碘伏消毒皮肤。②于正中线旁开约5mm处,行颈部右侧纵行切口,剪开浅筋膜,暴露右侧胸锁乳突肌,在胸锁乳突肌与颈前肌群之间向深部钝性分离,暴露颈动脉鞘,玻璃分针游离颈总动脉(CCA)和迷走神经,直至 CCA分叉处。钝性分离向内行走的颈外动脉(ECA)及向外后行走的颈内动脉(ICA)。③分别在CCA、ECA、ICA下方穿线,结扎CCA近心端、颈外动脉近分叉部。④在CCA上距其末端约5.0mm处剪一小口,将线栓沿ICA方向连续轻柔推进,插入(18.0±0.5)mm时遇到轻微阻力即止,然后于ICA近心端结扎该动脉,全层缝合切口,并留置长约3cm的尼龙线于体外,碘伏消毒手术区。缺血1h后拔出阻塞线约10min实现再灌注。假手术组(Sham组):插线深度小于10mm,其余处理不变。
5.MCAO操作中的注意事项 首先,在实验中需注意麻醉药物的浓度和剂量,保持气道通畅。避免刺激气管,防止因分泌物过多而引起窒息死亡。其次,分离颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉时一定要注意勿损伤迷走神经,并将血管周围的结缔组织剥离干净,为线栓插入做好准备。同时注意勿伤及血管以防止大出血所致的死亡。CCA上剪口是手术关键步骤之一,眼科剪要锐利,剪口时剪刀与血管正上方约成60°角,剪口不宜太大,否则血管容易断裂造成实验失败。以不超过CCA壁上1/4为宜,但也不宜太小,否则入线困难。
尼龙线栓的制备是MCAO手术中又一关键环节,线栓头端需修剪打磨圆钝,防止头端过于锋利而刺破血管,引发蛛网膜下腔出血而死亡。此外,线栓预先浸蘸肝素钠,一般认为可减少阻塞期间动脉血栓的形成。手术中,需尤其注意线栓连续缓慢推进时遇到轻微阻力即止,插线深度一般在18mm左右时可抵达MCA起始处或至大脑前动脉,线栓在血管内切忌顿挫式推进,否则可能由于无法体察轻微阻力而造成入线过深;当然也需防止因插线深度不足而导致线栓不能有效地阻断大脑中动脉血流。
术后缝合时,需注意勿碰触线栓,因为线栓轻微外移有可能造成MCA血流阻断失败。缺血结束后,在实施再灌注时,需注意回撤线栓一定要轻柔,切忌动作过猛或直接将线栓拔出而造成出血。另外还应注意术中对大鼠的保温,以及术后食物和水的供给。
四、实验结果
动物醒后约1h,即出现神经功能缺损情况,并借此判定手术成功性。TTC染色可检测手术成功的动物出现脑梗死灶。常规组织切片染色可见脑缺血区神经元、胶质细胞、血管及神经毡等损伤,以及星形胶质细胞增生、活化,炎细胞浸润等病理变化。
五、结果分析
(一)神经功能学评分
神经功能包括意识状态、运动、感觉、视觉、共济和神经反射等多方面,在临床神经功能检查中以上方面都会得到体现。MCAO动物研究中,可根据动物的生理病理特点,从运动、感觉、意识、神经反射等方面检测动物的神经功能损伤和恢复程度。神经功能学评价不仅是判断模型成功与否的指标,也为观测病理生理发生发展的进程、模型规范化及药物干预的研究提供了一定的依据。
1.Zea Longa法 Zea Longa法为5级0~4分制:0分,无神经损伤;1分,提尾时对侧前肢内收屈曲(轻度神经损伤);2分,爬行时向对侧旋转(中度神经损伤);3分,站立或爬行时,向对侧倾倒(重度神经损伤);4分,无自主活动伴意识障碍。
通常MCAO再灌注动物模型制作成功后,死亡主要发生在2d内,而再灌注3d后,动物的死亡率则大大降低。此外,大部分3分者及所有4分者多在24h内死亡,2d内的死亡率几乎是100%,主要原因是手术造成蛛网膜下腔出血和(或)脑水肿,因此所有不同再灌注时间点内的动物,取材时需摒弃蛛网膜下腔出血者。客观地讲,缺血1h的MCAO再灌注动物模型的“有效”成功率通常在60%左右,而缺血超过1h的MCAO再灌注动物模型“有效”成功率则更低。因此,在MCAO再灌注动物模型中,最有价值的应该是Zea Longa评分1~2分者。此外,有部分Zea Loga评分1分者的神经缺损症状可在1d内消失,取材后证实梗死灶多数在纹状体区,而皮质区无梗死。
需要强调的是,术后部分大鼠出现缺血侧瞳孔缩小、眼裂变小等症状,即Horner征,由手术中损伤颈部交感神经,引起瞳孔开大肌与睑板平滑肌(Müler肌)麻痹所致,与脑缺血无关,因此不可将其视为手术成功的指标之一。在评分时,需注意1分为Zea Longa评分所有2~4分的基础分。也就是无1分的基础分。2~4分的评分应视为无效。
2.改良的Garcia JH评分 该方法从大鼠自主运动、体态对称性、前肢伸展功能、攀爬运动、身体双侧触觉、双侧胡须碰触反应等6个方面评估大鼠神经功能损伤的程度。分值为3~18分,数值越大,神经功能损伤越轻,18分为正常(表16-2)。
(二)组织取材
于再灌注预定时间点用3.6%水合氯醛麻醉后,仰卧位固定大鼠四肢,迅速用剪刀自剑突沿胸骨左缘剪断肋骨,暴露胸腔,用左手轻轻固定搏动的心脏,在心尖处剪开部分心壁,用9号灌注针(头端膨大钝圆)刺破心壁自左心室插入主动脉后,结扎固定灌注针,剪开右心耳,用生理盐水(50~100ml)快速灌注冲洗至右心耳流出液变清亮(根据不同的实验目的及要求,可在此时用10%中性甲醛或4%多聚甲醛做前固定处理)。用剪刀自枕骨大孔处迅速剪断脊髓,剪开头皮,暴露颅顶,剪掉颅顶部肌肉组织,用剪刀刻划各骨缝,用咬骨钳咬开枕骨大孔及枕骨暴露出小脑及左右顶骨的后缘,用止血钳将顶骨后缘沿正中骨缝向两侧掀开顶骨,暴露两侧大脑半球,然后用咬骨钳咬掉两侧部分颞骨及额骨,露出脑组织。用眼科剪将脑干底侧脑神经剪断,并剪开硬脑膜,轻轻掀起脑干,自后向前剪断颅底三叉神经和视神经,将整个脑与颅底结构分离,最后剥离嗅球并取出完整脑。
整个取脑过程要求速度快。用时应尽量不超过10min,有条件者整个取脑过程可在冰浴中进行。取脑操作需轻柔,切忌刺伤、挤压脑组织,剪开硬脑膜要彻底,避免因硬脑膜牵拉而损伤脑组织。此外,需观察大鼠插线侧大脑动脉环MCA起始处附近有无出血情况等。
(三)形态学观察
2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法观察脑梗死灶:TTC染色后,未缺血部分呈玫瑰红色,而脑梗死灶呈苍白色(在MCA供血范围内),证实模型制作成功。
(1)TTC染色原理:TTC为一种水溶性盐,是呼吸链中吡啶一核苷结构酶系统的质子受体,与正常组织中的脱氢酶反应,产生深红色、光酶脂溶性的Formazan而使正常组织呈玫瑰红色:缺血组织内线粒体损伤、脱氢酶活性下降,不能诱导染色反应而呈苍白色。
(2)TTC染色步骤:将脑立即置于-20℃冰箱冷冻10min,用锋利双面剃须刀片按约2mm厚度,在距额、枕极2mm间做连续冠状切片,共取5~6个脑片。将脑片置于含0.5% TTC(用0.01mol/L的PBS配制,用时现配)的培养皿内,滤纸覆盖脑表面,37℃恒温培养箱避光染色20min。期间注意不时翻动脑片,以使染色均匀。
(四)组织学观察
取脑后,可选取距离额极6mm、3~4mm厚脑片行组织学检查。石蜡制片或冰冻制片后。行常规HE染色(或Nissl染色、免疫组化染色等),在光镜下观察脑缺血后形态学改变,或制成超薄切片行电镜检查(图16-3)。
光镜下。正常组动物神经元、胶质细胞及毛细血管形态正常,结构完整,核仁清晰,细胞质无红染,神经毡致密,无脱髓鞘现象,无炎细胞渗出。模型组:局灶性脑缺血-再灌注1d,脑皮质缺血区组织水肿明显,星形胶质细胞肿胀,神经元肿胀,中央尼氏体消失,可见红色神经元、神经元核固缩等神经元死亡现象及轴突崩解及脱髓鞘现象,可见中性粒细胞渗出;再灌注3d,神经元皱缩、死亡加剧,并可见少量小胶质细胞浸润,星形胶质细胞增生;再灌注7d,可见大量小胶质细胞吞噬坏死的神经组织,形成Gitter或Foamy(格子或称泡沫)细胞,缺血周围区神经元明显减少。星形胶质细胞及血管增生现象十分显著。
电镜下,毛细血管正常,内皮细胞和神经元未见水肿,常染色质分布均匀,染色体无异常,核膜完整,线粒体丰富,嵴清晰完整,细胞器正常。模型组:局灶性脑缺血后,毛细血管周围高度水肿,基膜稍增厚,血管内皮细胞内线粒体数目减少,线粒体的大部分嵴融合消失,部分核膜融合消失。神经元核深染,染色质聚集、周边化,线粒体肿胀,嵴减少或消失,呈空泡状。内质网池扩张变形等结构改变,并且随缺血时间延长,突触结构异常,突触密度下降。
六、经验与体会
线栓法制备MCAO模型,方法较简单,不需要开颅暴露MCA,对动物损伤轻,对全身影响小,重复性较好,成功率相对较高,尤其是能准确控制缺血,再灌注时间。不足之处是,首先尼龙线入颅后的操作是在非直视下进行的,血流阻断与否无法直接判断;所需尼龙线栓的直径、头端加工、入线深度等都需根据模型动物进行相应调整,此外,大鼠的品系、批次、血管个体差异、年龄、体重、性别等都是影响脑梗死范围的因素,因此该模型脑梗死灶通常不易恒定。另外,临床上,脑卒中患者多见于老年人,而MCAO模型因考虑手术成功性及易行性,通常不采用老年大鼠制备,因此MCAO动物模型的实验室研究资料与临床病理过程显然存在较大差异。