摘要：从受精直到受精后六天（dpf），将新受精的斑马鱼胚胎暴露于浓度不断增加的选择性5-羟色胺再摄取抑制剂（SSRI）西酞普兰中。使用自动ZebraBox红外跟踪系统在6 dpf时采集运动活动数据。在交替照明条件下（0%光照，即黑暗期，100%光照，即光照期），75分钟内记录个体（n=32）的运动能力。测试的前15分钟包括一个黑暗的时期，即适应阶段。之后，进行了六个交替的明暗时段。 个体斑马鱼胚胎幼虫的运动被跟踪并聚集在10秒钟的容器里。数据集包含9个与运动相关的量化终点（因子），使用R软件进行分析、分析和可视化。数据集及其相关的自定义R脚本可用于进一步探索暴露于西酞普兰或其他神经活性化学物质后的运动活动结果（例如抗焦虑或抗焦虑特性）。

 

 

实验设计、材料和方法:斑马鱼胚胎：在每次测试前一天，将实验室饲养的成年斑马鱼转移到10 L水族箱（26°C）中的金属网（5 mm网眼）繁殖笼中。第二天产卵。产卵后，对各产卵组的受精成功率和畸形率进行评估，收集不合格卵发生率最低的组进行胚胎暴露处理。卵在经过碳过滤的充气自来水中冲洗，以清除碎屑。在受精后大约3小时，当胚胎已经达到1K细胞到“高”发育阶段时，暴露于试验溶液中。挑选出显示同步发育的胚胎进行测试。

 

胚胎暴露：受精胚胎（n=32/处理液）分布在培养皿中，培养皿中装满40毫升试验溶液（对照和5种化学处理液）。对照水为碳过滤曝气自来水。通过混合和涡旋将西酞普兰溶解在对照水中，无需添加其他溶剂，并按5：1的比例稀释至5种处理。从每个培养皿中用移液管将胚胎连同200μL溶液移入96孔板（每个孔一个胚胎）。每个孔中的水柱达到孔高度的2/3（孔体积：300μL），允许有空气柱，从而促进发育中的胚胎幼虫的正常膀胱充气。如图2所示，将治疗组按对角线排列，以消除位置偏差（例如，与板边缘相比，板中心的温度差异）。将每种处理的16个独立重复个体分别置于两个96孔板中。将板用Parafilm M覆盖，并保存在环境控制的实验室中（日光周期12:12 h（09：00-21：00），气温26±1°C）。孵育至受精后6天，进行运动活性测定。

 

运动活性测定：在6个dpf下进行运动活性测定。在将板放入记录室之前，要对板进行最少的处理。在放置在ZebraBox?记录室之前，极简地处理这些板。记录室配有一个红外发光地板和一个顶装红外摄像机，可以在光线和黑暗条件下对整个平板进行一致的录像。使用ZebraLab软件对光循环方案进行编程，该方案由15分钟的初始适应步骤和六个交替的十分钟的明暗阶段组成。斑马鱼的胚胎幼虫会通过运动活动的增加对从100％照明到0％照明的瞬时转变做出反应。与对照相比，抗焦虑化合物（例如西酞普兰）可以减少这种反应，从而在黑暗时期降低活性。 另一方面，在黑暗时期，产生焦虑性的化合物可能会进一步诱导幼虫活动过度。分析是在下午（12:00–15:00）进行的，因为胚胎幼虫对光照变化的反应在一天中的这个时间段内变化最小。为运动定义了三个活动阈值：不活动（运动速度<3 mm/s）、小运动（运动速度3–6 mm）和大运动（运动速度>6 mm/s）。斑马鱼胚胎幼虫的运动数据被聚合到每个个体的10秒钟的容器中，分成9个与运动相关的活动变量。75分钟的分析完成后，将96孔板从记录室中取出。  在通过立体显微镜进行形态学评估之前，将高剂量的pH缓冲甲磺酸三卡因（MS-222）加入到使幼虫失去能力的每个孔中。

 

运动活动数据处理：简而言之，.csv文件已导入，汇总和合并。 为了不混淆数据分析，从数据集中省略了形态受到影响的个体（例如，没有膨胀的游泳膀胱）的观察结果。总结了每分钟、光照和暗照期间的个体总游泳距离。总结了每一个体胚胎幼虫的运动活动数据（即黑暗条件下的总游动距离），并使用单向方差分析（ANOVA）和正态分布评估进行分析。使用multcomp R软件包通过Dunnett的事后测试评估显著的治疗效果。p值<0.05（*）、<0.01（***）和<0.001（***）的治疗组被认为与对照组有显著差异。