一、实验目的

帕金森病(Parkinson's disease, PD)简称Parkinson病，也称为震颤麻痹(paralysis agitans, shaking palsy)，是中老年人常见的神经系统变性疾病，也是中老年人最常见的锥体外系疾病。流行病学调查研究显示，65岁以上人群患病率为1000/10万，随年龄增高，男性稍多于女性。该病的主要临床特点是：静止性震颤、动作迟缓及减少、肌张力增高、姿势不稳等。在老龄化日益严重的我国，其预防和治疗也越来越受到关注。本章介绍一种笔者实验室PD模型制作的方法及行为学评价体系。为PD发病机制的研究提供实验室支持。

二、实验原理

现代研究认为，PD的发病机制与脑内黑质，纹状体系统中多巴胺(dopamine, DA)含量减少有关。6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)是一种神经毒剂，可以选择性破坏含DA的神经细胞。目前建立PD动物模型最常用的方法是将6-OHDA注射到大鼠中脑。从而造成中脑黑质部位的多巴胺能神经元特异性损伤。诱导旋转行为的PD动物模型。本实验参照包新民所著《大鼠脑立体定位图谱》在脑立体定位仪下确定坐标，通过一侧纹状体前后两点注射6-OHDA，6-OHDA经逆行转运从而损伤黑质，导致DA能神经元损伤来制备大鼠PD模型，并对此模型进行行为学评价。

三、实验材料与方法

(一)实验材料

1.所需设备  电热压力蒸汽灭菌器；微量电子天平；电热恒温鼓风干燥箱；水平电泳仪；电热蒸馏水器；20μl、100μl、200μl、1000μl可调微量加样枪；手术器械：眼科剪、解剖剪、蚊式钳、有齿镊、无齿镊。

2.实验动物及试剂  本实验动物选用成年健康大鼠(昆明医科大学实验动物中心提供)，体重180～220g，7月龄，雌雄各半，经反复检测无异常旋转行为。随机分为两组：6-OHDA实验组、对照组，每组动物10只，动物自由饮食，室温22～25℃。

(二)实验方法

1.造模方法  大鼠术前禁食12h。实验组动物用3.6％水合氯醛(1.5ml/100g)腹腔注射。而后将其放到新的鼠笼中，待其出现麻醉症状后再进行手术操作。麻醉成功后将大鼠腹位、四肢外展，用橡皮筋将其固定于立体定位仪上，呈俯卧位。将大鼠舌头轻轻拉向一边尽量保持呼吸通畅。

常规消毒，切开头皮和皮下组织，钝性分离颅骨外膜，充分暴露前囟及右侧颅骨。将齿棒设定为2.4mm，确定前囟坐标。根据包新民所著《大鼠脑立体定位图谱》，确定右侧纹状体两个注射点的坐标。第一点为前囟前1.0mm，矢状缝右侧3.0mm，硬膜下4.5mm；第二点为前囟后1.0mm，矢状缝右侧4.5mm，硬膜下6.0mm。在上述选定的坐标点用微型磨钻钻颅，用微量注射器将2μg/μl的6-OHDA(溶于0.2％抗坏血酸生理盐水中)5μl分别注入实验组动物的上述两点，注射速度为1μl/min，注毕留针10min，退针速度为1mm/min，以防药液溢出。退针后常规缝合头皮，术毕腹腔注射青霉素10万U/100g。对照组在上述右侧纹状体的两点注射入0.2％抗坏血酸生理盐水5μl，其余处理同实验组。苏醒后两组动物均在同一环境下饲喂。

2.旋转行为检测  分别在术后1周、2周、4周、6周、8周和10周于颈部皮下注射0.1％阿扑吗啡(apomorphine, APO; 1ml/kg)，诱发大鼠向健侧的单向旋转行为，PD模型旋转检测仪记录动物向对侧旋转情况，旋转360°为1次，每次记录30min。一般认为，平均旋转次数≥7转/min为成功的PD大鼠模型。

(三)实验结果

实验组大鼠有1只术后死亡，其余存活良好，未出现明确的手术并发症。术后1周可观察到偶发的旋转行为，但不超过3次/min。术后4周共7只大鼠恒定向健侧旋转，且旋转出现圈数达到成功PD模型标准。术后1～2周大鼠的旋转次数与4～6周相比具有显著性差异(P<0.05)。术后4周大鼠的旋转次数与6周相比无显著性差异。对照组术后一直未诱发出旋转行为，所有动物均存活良好，无一只死亡。

(四)结果分析

中枢神经系统损伤在帕金森病(PD)的进展过程中持续不断地发生，对PD的治疗关键在于防止病情进展、修复和延缓多巴胺(DA)能神经元的损害，而PD动物模型的制作无疑在PD的实验研究中有着举足轻重的作用。对于单侧黑质损毁模型，同侧的黑质纹状体通路被破坏，纹状体内的神经元失去多巴胺能神经元的支配，其多巴胺受体便处于一种超敏状态，当给予外源性多巴胺受体激动剂如阿扑吗啡后，动物损伤侧的反应就强于健侧而无法保持平衡，并向健侧旋转，旋转的频率大致与黑质内的多巴胺能神经元的受损程度一致。因此，本研究所采用的方法成功完成了PD模型的制作，为今后的研究打下了基础。