一、实验目的

熟悉建立甲基苯丙胺依赖大鼠模型的方法，复制甲基苯丙胺依赖大鼠模型，观察大鼠的条件性位置偏爱实验结果和刻板行为的结果。

二、实验材料与方法

(一)实验材料

1.所需设备

(1)大鼠条件性位置偏爱实验室：安静、隔音的实验室，配备动物行为学分析系统，用于观察和记录实验大鼠的条件性位置偏爱(conditioned place preference, CPP)实验数据。按照厂家提供的操作程序操作。

(2)微量电子天平：称量药品。

(3)普通电子天平：称量大鼠体重。

(4)大鼠饲养笼具及相关设施(含饮水、喂食、垫料)等。

2.所需试剂

(1)甲基苯丙胺标准品(10mg/支)：甲基苯丙胺作为毒麻药品，严格遵循学校关于毒麻药品试剂管理的相关规章制度，包括事先的使用计划审批、采购，日常管理中双锁双人保险柜管理，使用时领用登记等。

(2)0.9％氯化钠注射液：500ml/瓶，批号为国药准字H20056626。常温保存。

3.试剂配制  甲基苯丙胺标准品为粉末状药品，使用前准确称量后，用0.9％氯化钠注射液配制成浓度为5mg/ml的溶液，根据每日注射需要的用量使用前配制，当日使用。例如，大鼠40只，每只体重约为200g，则总体重为8kg，需要药物总量为80mg，加上5mg的损耗(注射器多次抽吸导致液体损耗)，准确称量85mg药物，配制成17ml的溶液备用。

(二)实验具体方法和操作步骤

1.实验程序  实验动物：健康Sprague-Dawley大鼠40只，体重(220±20)g，由昆明医科大学实验动物中心提供。随机分为5组：对照组(n=8)、甲基苯丙胺依赖1周组(n=8)、甲基苯丙胺依赖2周组(n=8)、甲基苯丙胺依赖4周组(n=8)、甲基苯丙胺依赖8周组(n=8)。实验进行前，实验动物先在室内分笼饲养1周，自由进食、饮水，自然节律光照。观察实验大鼠活动量、饮水量及大小便情况。1周后，采用倾向性程序进行大鼠条件性位置偏爱实验，并记录实验结果。

采用倾向性实验程序进行CPP实验，即在未给药适应时记录每只大鼠的天然偏爱侧。实验时将每只大鼠的非天然偏爱侧作为伴药盒进行CPP实验。实验大鼠先适应 CPP装置3d，每天1次，每次15min。即将大鼠放入CPP箱子内，移去中间的隔板，使大鼠可以在左右两个箱体及通道内自由活动：第3天记录每只大鼠在白盒和黑盒的平均停留时间，确定大鼠的天然偏爱倾向。3d适应结束后。将每只动物的非偏爱侧箱子作为伴药盒(即给药后就将大鼠放入该侧盒子中)。然后腹腔注射甲基苯丙胺10mg/kg，每天1次，注射药物后即放入伴药盒内，用隔板封闭通道，观察30min，同时记录大鼠的刻板行为并评分。连续注射甲基苯丙胺并训练大鼠10d。对照组给予相同剂量的生理盐水注射，同样训练10d。第11天实验组和对照组动物均进行CPP实验测定，测试前将隔板打开，使大鼠能够在两个盒子内自由活动，记录动物在两侧箱体停留的时间(用秒作为时间单位)。进行统计学处理。

根据CPP实验结果分析确认动物建立了明显的药物依赖后。4个依赖组的动物再腹腔注射甲基苯丙胺10mg/kg，每天1次，持续注射时间分别为1周、2周、4周、8周，建立4个不同依赖时间段的依赖大鼠模型。并且分别在注射1周、2周、4周、8周完成后的第2天进行CPP实验，记录实验结果。

2.刻板行为评分  实验大鼠在进行CPP实验时，同时观察各组大鼠刻板行为(stereo  typed behavior, SB)。评分参照Sams-Dodd F的方法，每5～10min评分1次(表18-1)。

记录刻板行为持续时间(30min)，以刻板行为评分≥2分，刻板行为持续时间≥15min为合格模型。

(三)实验操作中各步注意事项

(1)在注射药物时注意无菌操作，大鼠腹部皮肤采用75％医用酒精消毒，使用1ml一次性注射器注射药物(或盐水)，每只大鼠一支注射器，避免交叉污染。

(2)大鼠在CPP适应期间的观察是确定伴药盒的前提，因此对观察者进行CPP实验程序的培训是获得客观观察结果的前提。

(3)CPP装置每次使用完毕后，需用75％医用酒精仔细擦拭并等待其干燥，再进行后续操作。目的是清洁并消除气味，避免先前实验大鼠对后续实验大鼠的干扰。

三、实验结果

(一)实验大鼠模型的CPP结果

生理盐水对照组大鼠在伴药盒的平均停留时间为(377±57)s，MA依赖1周组大鼠在伴药盒的平均停留时间为(581±185)s，MA依赖2周组大鼠在伴药盒的平均停留时间为(660±270)s，MA依赖4周组大鼠在伴药盒的平均停留时间为(507±74)s，MA依赖8周组大鼠在伴药盒的平均停留时间为(490±89)s。经过配对t检验，对照组与4个甲基苯丙胺依赖组之间均有统计学差异(P<0.05)，表明4个甲基苯丙胺依赖组大鼠产生了条件性位置偏爱(表18-2)。

(二)刻板行为评分结果

每10min进行评分一次。通过对实验大鼠刻板行为的观察，发现甲基苯丙胺依赖组大鼠注射后出现明显刻板行为症状，统计各组大鼠刻板行为次数，对照组和4个甲基苯丙胺依赖组比较，右明显差异，评分结果见表18-3。

除了Sams-Dodd F方法中的刻板行为以外，还观察到甲基苯丙胺依赖大鼠出现其他明显的异常行为，主要是有竖尾，肌张力亢进，身体趴下并四肢向前伸展，易激惹，缓慢摇头并间断运动，以及部分动物出现吃大便、咀嚼木屑、自残肢体、相互攻击等；还可见动物大便增多、流涎等表现。

同时甲基苯丙胺依赖大鼠注射药物后刻板行为持续时间较长，给药4～8h后仍然有易激惹、活动增加、肌张力亢进及竖尾等症状。特别是刚开始注射药物阶段的大鼠，在药物注射12h以后还有易激惹、肌张力亢进症状存在。

(三)大鼠模型的评价

本实验采用长时间多次腹腔注射给药的方法来建立甲基苯丙胺依赖大鼠模型，采用 CPP并结合刻板行为评分方法来评价动物模型的建立成功与否。

通过实验发现，经过10d的腹腔给药后，实验组的大鼠出现了明显的CPP表现，大鼠在伴药盒停留的时间与在非伴药盒停留的时间具有明显差异，说明大鼠已经对药物形成依赖性。

同时，还观察到本实验中大鼠给药后在行为学上表现出一些在文献中的刻板行为评分标准中没有描述到的表现。例如，易激惹、持续竖尾、趴下并四肢向前伸展、缓慢摇头并间断运动、自残及群体内部相互攻击等。甲基苯丙胺给药后出现的行为学改变持续的时间较长。作者观察到大鼠在给药4～8h后仍然存在易激惹、活动增加及竖尾等行为学改变，这与甲基苯丙胺在体内代谢及持续作用时间较长有关。

四、结果分析

通过腹腔注射甲基苯丙胺，采用条件性位置偏爱实验结合刻板行为评分的方法，成功建立了甲基苯丙胺依赖大鼠模型。

本方法具有操作简便、容易观察、动物死亡率低、评价标准简便易行等优点，是较好的建立甲基苯丙胺依赖动物模型的方法。

五、经验与体会

(1)根据实验大鼠CPP和刻板行为评分结果，本实验成功建立了甲基苯丙胺依赖大鼠模型。

(2)研究结果提示，将条件性位置偏爱实验和刻板行为评分结合起来，是评价甲基苯丙胺依赖模型建立与否的可靠评价方法。实验结果具有科学性、客观性及重复性，是目前较好的甲基苯丙胺依赖动物模型建模方法和评价指标。

(3)甲基苯丙胺依赖动物模型建立方法需要进一步深入研究，并且需将评分标准进一步细化。对甲基苯丙胺的动物模型进行系统分类，将甲基苯丙胺依赖大鼠模型建立方法和评价体系进一步完善。