目的：两个月前，中国武汉报道了一种新出现的人类冠状病毒（HCoV）（COVID-19）。迄今为止，，在中国和其他40个国家报告的8万例确诊病例中，有2700人死亡。一个月前中国证实了COVID-1存在人与人的传播。根据世界卫生组织（WHO）的报告，SARS-HCoV导致8000多例病例，774人死亡。此外，MERS HCoV导致约2500例报告病例中的858例死亡。 目前的研究旨在测试抗HCV药物对抗COVID-19 RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）的能力。本研究旨在检测抗HCV药物对COVID-19 RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）的抑制作用。

材料和方法: 本文采用序列分析、建模和对接的方法，建立了武汉COVID-19rdrp的模型。新出现的武汉HCoV RdRp模型是以抗多聚酶药物为靶点的，包括已批准的索非布韦和利巴韦林药物。

主要发现：结果表明，索非布韦、IDX-184、利巴韦林和瑞德西韦是治疗新出现的HCoV疾病的有效药物。本研究为COVID-19 RdRp提供了一个完美的模型，使其能够在计算机上针对抗聚合酶药物进行测试。这项研究还提出了一些药物，以前证明它对新出现的病毒感染有效。

关键词：武汉冠状病毒  COVID-19  RdRp  结构生物信息学  索非布韦 核苷酸抑制剂

简介：根据2020年1月的世界卫生组织（WHO）监视草案，在症状发作前两周到中国湖北省武汉市的任何旅行者均被怀疑是COVID-19患者。此外，世卫组织还向为新出现的疫情和感染防治指南进行检测的实验室分发了临时指南。COVID-19病毒性肺炎与海产品市场有关，当时一种未知动物是爆发的原因。其他国家开始监视边境以防止新的未知冠状病毒的传播。直到一个月前，中国有41例确诊为COVID-19阳性，其中1例死亡，7例处于重症监护中。这个数字每天都在急剧增加，在手稿撰写之日，确诊病例超过80000例，死亡人数超过2700人。2020年1月20日，中国国家卫生健康委员会确认武汉疫情（COVID-19）为人传人。症状包括发烧、不适、干咳、气短和呼吸困难。COVID-19是Betacoronaviruses的成员，如严重的急性呼吸综合征人类冠状病毒（SARS HCoV）和中东呼吸综合征人类冠状病毒（MERS HCoV）。直到今天，除新出现的COVID-19外，还报告了六种不同的人类冠状病毒（HCoV）株。229E和NL63株HCoVs属于α冠状病毒，OC43、HKU1、SARS、MERS和COVID-19株HCoVs属于β冠状病毒。SARS和MERS-HCoV是最具攻击性的冠状病毒株，每株病毒约有800人死亡。世卫组织称，SARS-HCoV的死亡率为10%，MERS-HCoV的死亡率为36%。HCoVs一般为正义，单链RNA病毒（30000bp）。HCoVs有两类蛋白：结构蛋白，如Spike（S）、核衣壳（N）基质（M）和包膜（E），非结构蛋白，如RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）（nsp12）。RdRp是包括冠状病毒在内的RNA病毒生命周期中的关键酶。 RdRp靶向不同的RNA病毒，包括丙型肝炎病毒（HCV），寨卡病毒（ZIKV）和冠状病毒（CoV）。RdRp的活性位点高度保守，代表两个连续的天冬氨酸残基，这些残基从β转角结构突出，使其可通过核苷酸通道）进入表面。此外，正在尝试针对不同的病毒大量开发抗RdRp的化合物进行临床试验。利巴韦林对COVID-19的半数最大有效浓度（EC50）为109.5μM，对登革病毒的半数最大抑制浓度（IC50）为8μM。Sofosbuvir对Zika病毒半数最大抑制浓度（IC50）为4μM。瑞德西韦在体外对COVID-19的EC90为1.76μM。 由于其有力的抑制新兴病毒RdRps的有力证据，我们在本研究中将重点放在核苷酸抑制剂上。在与蛋白质数据库中的可用结构进行序列比较之后，我们使用同源性建模来构建COVID-19RdRp模型。然后进行分子对接，以测试一些针对COVID-19RdRp有直接作用的抗病毒药物（DAA）（索非布韦，利巴韦林，瑞德西韦，IDX-184）。此外，还根据COVID-19RdRp模型测试了IDX-184和索非布韦的天然核苷酸GTP和UTP。

材料和方法  序列比对与建模: 从NCBI核苷酸数据库中检索了新出现的COVID-19的第一个可用的全基因组序列。Swiss Model Web服务器使用其自动模式为RdRp构建模型。以SARS-HcoV解析结构（PDB-ID:6NUR，链A）为模板，与COVID-19rdrp序列同源性为97.08%。去年存入杜克大学的Molpropolity网络服务器蛋白质数据库，并利用加州大学洛杉矶分校（UCLA）的结构分析与验证服务器（SAVES）对模型进行了测试。除了Molprobity的Ramachandran图外，用于判断模型有效性的程序还有PROCHECK，Verify 3D，PROVE和ERRAT。验证后，计算化学工作区SCIGRESS用于最小化模型和进行分子对接实验。模型的最小化是在加入缺失的氢原子后利用MM3力场进行的。

分子对接：利用优化后的COVID-19和SARS（PDB-ID:6NUR，chain A）RdRps，利用scigres中的AutoDock-Vina软件进行对接实验。针对武汉COVID-19 RdRp测试了八种不同的化合物，包括索非布韦，IDX-184，利巴韦林，瑞德西韦，鸟苷三磷酸（GTP），尿嘧啶三磷酸（UTP），肉桂醛和胸腺醌。索非布韦是2013年度美国食品药品监督管理局（FDA）批准的抗丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白5（NS5B）RdRp药物。对其他病毒包括寨卡病毒有很好的效果。IDX-184正在进行抗HCV的临床试验，与其他抗HCV、MERS、SARS-HCoVs和寨卡病毒RdRps的药物相比，其疗效更好。利巴韦林是一种广谱的抗病毒药物，与免疫调节剂或直接作用的抗病毒药物联合治疗不同的病毒。瑞德西韦是一种核苷酸类似物，用于治疗埃博拉病毒、马尔堡病毒、MERS和SARS感染。肉桂醛和胸腺醌是阴性对照化合物，证明其对HCV和寨卡病毒中的RdRp无活性。对接后，借助蛋白质配体相互作用分析器（PLIP）Web服务器检查结构并制成表格以进行比较。

结果与讨论：COVID-19 RdRp建模：图1A示出了来自不同HCoV株（包括α冠状病毒（229E和NL63）和β冠状病毒（OC43、HKU1、SARS、MERS和COVID-19）的RNA依赖性RNA聚合酶的多序列比对（MSA）。SARS HCoV二级结构显示在MSA的顶部（PDB ID：6NUR链：A），而其水可及性位于MSA的底部。 易于接近的残留物位于蓝色框中，而埋藏的残留物在MSA底部以白色表示。黑色虚线矩形标记活性位点残基（连续的天冬氨酸残基D255和D256）。活性位点天冬氨酸从连接β15和β16的β转角突出。正如MSA所暗示的，活性位点高度保守（以红色突出显示）。此外，D255和D256周围的5 区域在所有hcov中高度保守，如蓝色虚线矩形所示。该区域包括Y114、C117、N186、N190、M251、I252、L253、S254、A257、V258、E306、F307、C308和S309。活性位点残基及其周围的5Å大部分区域都是表面可及的，尽管可以与游离核苷酸（ATP，GTP，CTP和UTP）结合。

图1B显示了绿色带状（右）和绿色表面（左）表示中的COVID-19 RdRp模型的结构。活性部位残留物D255和D256为红色。从表面表示可以看出，该活性位点是表面可及的，从而允许其与通过RdRp核苷酸通道的游离核苷酸相互作用。尽管在COVID-19 RdRp中发现了一些插入，但这些插入与活动位点天冬氨酸分开，对模型质量影响很小。 另外，在进行对接研究之前，使用MM3力场将同源性构建的模型最小化，以确保其可靠性。

对于COVID-19 RdRp，与SARS，MERS，OC43，NL63、229E和HKU1 HCoV菌株的序列同一性百分比分别为90.18％，56.76％，55.07％，48.79％，48.55％和48.16％。 因此，SARS HCoV RdRp是最接近COVID-19。这些信息对于药物设计人员寻找一种快速有效的方法来对抗新出现的COVID-19是很重要的。

在SARS HCoV RdRp（PDB ID：6NUR，链A）作为同源物的情况下，借助于自动同源性建模Swiss Server网络服务器，构建了COVID-19 RdRp模型（801个残基）。该模型与模板具有很高的序列同一性（97.08％），这表明可以得到高质量的模型。根据我们从验证web服务器获得的值，该模型是有效的。此外，根据Verify 3D软件，89.9％的残留物平均3D-1D分数≤0.2，而ERRAT的总体质量因子为95.9％。

DAA与COVID-19RdRp的结合：在进行对接研究之前，已制备小分子（GTP、UTP、索非布韦，IDX-184，利巴韦林，瑞德西韦、肉桂醛和胸腺醌）的结构，确保其为优化的三磷酸形式。使用MM3进行优化，然后使用PM6力场，然后通过密度泛函理论（DFT）量子力学的B3LYP泛函进行进一步优化。在对接实验期间，活动位点天冬氨酸D255和D256被视为灵活的。AutoDock Vina利用其评分功能（Vina）来预测上述配体与RdRps活性位点之间的相互作用。图2显示COVID-19（蓝色列）和SARS-HCoVs（橙色列）的对接得分值。SARS解析的结构（PDB ID：6NUR，链A）用于对接相同的配体，以便将其结合能与COVID-19 RdRp的结合能进行比较。包括生理性GTP和UTP以及四种药物IDX-184，索非布韦，利巴韦林和瑞德西韦可以结合COVID-19和SARS HCoV RdRps并具有良好的结合能。尽管SARS HCoV RdRp与COVID-19 RdRp相比显示出稍高的结合能（结合力较低），但对于利巴韦林，瑞德西韦，索非布韦及其亲本核苷酸UTP而言，差异仍然不显著。另一方面，COVID-19和SARS HCoV RdRps与IDX-184及其亲本核苷酸GTP的结合能之差分别为2.3和1.6 kcal / mol。 此外，与SARS RdRp相比，所有测试的化合物对COVID-19 RdRp的结合能均较低（更好）。阴性对照化合物肉桂醛和胸腺醌均显示出与SARS或COVID-19的结合亲和力较低（高于-5.6 kcal / mol）。

为了检查结合能差异的可能原因，我们借助PLIP Web服务器检查了对接后形成的相互作用复合物。图3显示了DAA药物与COVID-19rdrp对接后形成的相互作用。每种复合物下方均列出了对接分数，以反映结合力。配体以橙色棒表示，而蛋白质残基以青色棒表示（标有一个字母代码）。H键是纯蓝色线，而虚线表示疏水性相互作用。在IDX-184与D514的情况下，仅形成一个盐桥（由虚线连接的黄色球体），这对形成的复合物具有增强的稳定性，反映在对接分数上。IDX-184、索非布韦和利巴韦林的H键数分别为11、7和13。另一方面，IDX-184和索非布韦都通过Mg+2分别与D652（两种相互作用）和E702形成金属相互作用。这是IDX-184和索非布韦形成的络合物稳定性增强的另一个原因。此外，索非布韦与COVID-19RdRp的Y510和D651形成了两种疏水作用。

综上所述，我们可以说IDX-184、索非布韦和利巴韦林可以与新近出现的冠状病毒RdRp紧密结合. 另外，IDX-184表现出更令人鼓舞的结果，随后索非布韦是一种针对HCoV新出现的COVID-19的有效抑制剂。 这两种化合物的进一步优化可以产生更有效的化合物，能够阻止新出现的感染。

结论：本研究旨在测试并建议目前市场上可能的抑制剂DAA药物立即停止COVID-19感染。 索非布韦、利巴韦林和瑞德西韦可用于对抗新型冠状病毒，并具有可喜的结果。 GTP衍生物可用作抗COVID-19的特异性抑制剂。

原文出自：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0024320520302253