冠状病毒核酸检测的研究进展与展望

来源:中国实验动物信息网 发布时间:2020年03月04日 浏览次数: 【字体: 收藏 打印文章

摘要:最近在中国由新型冠状病毒(SARS-CoV-2)引起的肺炎疫情暴发对全球公共卫生构成了巨大威胁。 因此,快速、准确地鉴定病原病毒,对于选择合适的治疗方法,挽救人们的生命,预防传染病的发生具有重要意义。建立快速的标准诊断测试以检测传染病(COVID-19)至关重要,以防止随后的继发性传播。聚合酶链反应(PCR)被认为是病毒和细菌感染基因诊断的金标准试验,具有较高的敏感性和特异性。恒温核酸扩增技术具有无需热循环操作、恒温下操作时间短等优点,被认为是一种非常有前途的候选方法。各种改进的或新的方法也已经开发出来。本文综述了目前可用的冠状病毒核酸检测方法。预计这将有助于研究人员和临床医生开发更好的技术,以便及时有效地检测冠状病毒感染。

关键词:冠状病毒  核酸检测  基于PCR的方法  基于恒温核酸扩增的方法  基于微阵列的方法

 

1、简介:尽管在公共卫生领域作出了巨大的努力和取得了重大进展,但与病毒引起的传染病的斗争仍然是一项具有挑战性和无止境的任务。传染病。对人类健康构成重大威胁。冠状病毒属于冠状病毒科,可能引起呼吸道和神经系统疾病。到目前为止,已鉴定出六种人类冠状病毒(HCoV),包括HCoV-229E,HCoV-HKU1,HCoV-OC43,HCoV-NL63,严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)和中东呼吸综合征冠状病毒(MERS- CoV)。 特别是SARS-CoV和MERS-CoV曾经引起大流行。近年来,新型冠状病毒(SARS-CoV-2)在我国的出现及其在全球范围内的传播,使全球公共卫生界面临一种新的传染病(冠状病毒病2019,COVID-19)的挑战。截至2020年2月22日,已确诊的COVID-19病例为77,816,死亡人数为2,012。

 

在本次流行中,SARS-CoV-2 RNA的检测有助于COVID-19的早期诊断,有助于控制感染源,帮助患者预防疾病的发展。因此,快速、准确地检测冠状病毒变得越来越重要。随着基因生物学技术的进步,核酸检测方法得到了迅速发展,成为病毒检测的革命性技术。特别是基于聚合酶链反应(PCR)的方法具有检测速度快、灵敏度高、特异性强等特点,被誉为病毒检测的“金标准”。 新的基于PCR的方法也被报道以提高检测的特异性和敏感性。此外,还开发了几种采用非PCR方法的基因测试,如恒温核酸扩增(环介导恒温扩增)和核酸序列扩增。在这项工作中,我们回顾了目前可用于检测冠状病毒的各种方法。预计这将有助于研究人员开发快速、准确的检测技术。

 

2、基于PCR的方法:PCR是一种酶促方法,通过分离含有基因片段的DNA的两条链,用引物标记其位置,并使用DNA聚合酶沿着每个片段组装一个拷贝并连续复制拷贝,从而产生大量的基因拷贝。它被广泛用于扩增微量生物材料,从而为实验室研究提供足够的标本。由于其应用范围广、灵敏度高、序列特异性强,已成为一种常规、可靠的冠状病毒检测技术。一般情况下,冠状病毒RNA通过反转录成为cDNA。然后,进行PCR,然后通过特定的检测方法或仪器检测PCR产物。 其中,PCR后的凝胶可视化和测序是检测冠状病毒的常规方法。然而,由于其耗时长、成本高,这些方法并不适用于临床样品。

 

实时逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测目前被冠状病毒检测所青睐,因为它具有特异性强,定量分析简便的优点。此外,实时RT-PCR比传统的RT-PCR更为敏感,对早期感染的诊断有很大帮助。因此,实时RT-PCR技术仍然是检测SARS-CoV-2等冠状病毒的主要方法。尽管如此,人们还是投入了大量的精力来改进实时RT-PCR检测方法。由于RT-PCR方法易受污染,需要耗时的样品处理和PCR后分析。van Elden等人描述了基于TaqMan的实时RT-PCR,可以很容易地在常规诊断设置中检测HCoV。 此外,为了进一步提高灵敏度,Yip等人使用2个TaqMan探针(而不是1个探针)设计了SARS-CoV的实时定量RT-PCR检测方法。使用双TaqMan探针进行量化的这种简单修饰在严重需要超敏反应的领域有着广泛的应用,SARS-CoV检测限为每反应1拷贝RNA。在临床检测中,缺乏安全和稳定的外部阳性对照(EPC)可能成为冠状病毒诊断中的严重问题,因此,针对此问题已引起了广泛关注。 但是,在EPC是重要组成部分的实时RT-PCR分析中,可以很好地避免此类问题。Yu等人建立了一种实时RT-PCR检测SARS冠状病毒的方法,该方法设置EPC,检测限为10拷贝/μL,。同时,冠状病毒的快速突变性质凸显了对准确检测遗传多样性冠状病毒的需求。因此,为了提高冠状病毒的准确检测能力,降低基因组序列变异引起假阴性结果的风险,研究建立了多重实时RT-PCR方法,对冠状病毒的多目标检测具有良好的敏感性。Hadjinicolaou等开发了使用耐错配基因信标的实时RT-PCR检测方法,以区分致病菌株和非致病菌株。该测定法包含四个信标,除了内部阳性对照外,还靶向四个基因。 它已使用临床样品进行了验证,显示了靶向检测能力和特异性,每个反应的检测极限为5个拷贝。

 

3、基于恒温核酸扩增的方法

 

3.1常规的基于LAMP的方法  LAMP是高效的新型恒温核酸扩增方法。 它通常用于DNA和RNA的扩增,由于其具有指数扩增特性,并分别由4种不同的引物同时鉴定出6种不同的靶序列,因此具有很高的灵敏度和特异性。LAMP测定快速且不需要昂贵的试剂或仪器。 因此,LAMP检测的应用可能有助于降低检测冠状病毒的成本。在此,已经开发了许多基于LAMP的冠状病毒检测方法并将其应用于临床诊断。

 

凝胶电泳通常用于分析扩增产物以进行终点检测。 潘等人报道了一种用于SARS诊断的简单LAMP检测方法,并证明了使用该技术检测SARS-CoV的可行性。选择SARS-CoV的ORF1b区域用于SARS诊断,并在6个引物的存在下通过LAMP反应进行扩增,然后通过凝胶电泳对扩增产物进行分析。LAMP分析中SARS-CoV的检测率和灵敏度与常规基于PCR的方法相似。Pyrc等人成功地将LAMP用于琼脂糖凝胶电泳检测HCoV-NL63,对细胞培养物和临床标本具有良好的灵敏度和特异性。值得注意的是,检测限为每个反应1个拷贝的RNA模板。

 

可以检测到焦磷酸镁或荧光染料的沉淀。 这使得该方法可以通过监测焦磷酸盐的浊度或荧光实时进行,有效地解决了终点检测的局限性。Shirato等人以这种方式开发了一种有用的RT-LAMP测定法,用于诊断和监测人类MERS-CoV的流行病学。它能够检测到3.4份MERS-CoV RNA拷贝,并且具有高度特异性,与其他呼吸道病毒无交叉反应。Thai等人建立了一种在分光光度计中实时监测浊度的单步单管加速实时定量RT-LAMP方法,用于SARS-CoV的早期快速诊断。在临床样品中,发现该检测方法的灵敏度比常规RT-PCR高100倍。

 

3.2 基于序列特定LAMP方法   然而,如果这些方法依赖于非特异性的信号转导机制,如荧光染料插入任何双链DNA扩增子,或由于聚合过程中焦磷酸盐的释放而导致溶液浑浊,则不能排除从引物二聚体或非引物反应中获得意外信号的可能性。一种用于监视LAMP和其他恒温扩增反应的序列特定且可靠的方法,可以轻松地将真实信号与非特异性噪声区分开来,将解决此问题。Shirato等人改进了RT-LAMP检测方法,采用淬灭探针(QProbe)进行信号监测,与标准实时RT-PCR检测MERS-CoV的方法具有相同的性能。此外,黄等人建立了结合RT-LAMP和RT-LAMP-VF来检测MERS-CoV的核酸可视化技术。如图1A所示,恒温扩增中涉及的两个环引物(LF和LB)分别用异硫氰酸荧光素(FITC)和生物素标记。扩增后,标记有生物素的扩增子可结合与链霉亲和素结合的胶体金颗粒,形成复合物,随后由涂在条带上的抗FITC抗体捕获(图1B),从而呈现肉眼可见的彩色线。在这种情况下,MERS-CoV-RNA的检测限为10拷贝/μL。

图1. RT-LAMP-VF分析的示意图。 (A)用于RT-LAMP的扩增反应(B)在可视化条上检测。

Ellington小组的科学家做了很多工作,既可以提高LAMP检测的特异性,又可以使读数更简单,更可靠。他们用称为单步链置换(OSD)介导的链交换反应代替了通常用于实时荧光监测的嵌入染料,并将其用于LAMP扩增子的实时序列特异性验证。所得检测结果可在30-50分钟内检测出受感染细胞培养上清液中的0.02-0.2 PFU(5-50 PFU / mL)MERS-CoV,并且不会与人类常见的呼吸道病原体发生交叉反应。还开发了其他链交换信号转导,以使LAMP反应易于使用。如图2所示,Du等人将LAMP与热稳定的转化酶结合使用。 可以直接将MERS冠状病毒模板转导为葡萄糖信号,这可以通过商业血糖仪轻松读取,灵敏度低至20–100拷贝/μL。人绒毛膜促性腺激素(hCG)也被用作信号,因为其分析物已经被商业妊娠检测试剂盒灵敏地检测到。在LAMP病毒检测中,hCG与DNA寡核苷酸特异性结合,从而允许信号转导通过链交换进入hCG的捕获(信号关闭)和释放(信号开启)。将一种工程化的hCG报告蛋白掺入到低成本的商用妊娠试验条上,导致LAMP-to-hCG信号转导。这种方法在人血清和唾液中都能可靠地检测到20份病毒模板。

 

图2.使恒温扩增适应血糖仪的方案。 该图经Ref许可转载

同时,LAMP在65°C左右的温度下表现出最佳性能,这始终限制了其应用。蔡等开发了一种LAMP版本,该版本使用了硫代磷酸化的引物(PS-LAMP),可以在辅助催化剂的末端更高效地形成和延伸发夹,从而在较低的温度下工作。用PS-LAMP在40°C下检测扩增子的灵敏度和选择性与65°C下常规LAMP反应相当。

 

3.3 基于滚环扩增放大的方法

滚环扩增(RCA)已在核酸测定中引起了广泛关注。在恒温条件下,RCA能够在90分钟内将每个滚环的信号放大109倍。建立了用RCA检测SARS-CoV的液相和固相分析方法,并对少量临床呼吸道标本进行了初步研究。RCA的主要优点是可以在恒温条件下用最少的试剂进行,并且避免了基于PCR的分析中经常遇到的假阳性。

 

4、基于微阵列的方法

 

微阵列是一种具有快速且高通量的检测方法。 对于这种方法,冠状病毒RNA将首先通过逆转录产生用特定探针标记的cDNA。然后将这些标记的cDNA加载到每个孔中,并与固定在微阵列上的固相寡核苷酸杂交,然后进行一系列洗涤步骤以去除游离DNA。最后,用特异性探针检测冠状病毒RNA。由于其优越性,微阵列技术在冠状病毒检测中得到了广泛的应用。

 

Shi等人根据TOR2序列设计了60mer寡核苷酸芯片,并成功应用于临床SARS冠状病毒的检测。然而,考虑到SARS冠状病毒的快速突变,郭等人研制了一种检测SARS-CoV棘突(S)基因24个单核苷酸多态性(SNP)突变的芯片,样品检测准确率达100%。由于冠状病毒可能导致突然爆发,因此诊断分析能够检测广泛的冠状病毒,并且在护理点(POC)或附近进行部署具有重要意义。因此,Luna等人设计了一种低成本、低密度的非荧光寡核苷酸阵列,用于检测整个冠状病毒属,其灵敏度与单个实时RT-PCR相当。Hardick等人评估了一种基于微阵列芯片的新型,便携式且接近POC的诊断平台,即移动分析平台(MAP),该平台在识别病毒和可接受的检测极限方面具有良好的性能。

 

5.新开发的方法:RNA靶向CRISPR相关酶Cas13最近已被应用于快速、便携式核酸检测。张的研究小组证明,Cas13可以通过剪辑来靶向和破坏多种哺乳动物单链RNA病毒的基因组。他们开发了一个名为SHERLOCK(特定的高灵敏度酶解报告基因解锁)的平台,该平台结合了等温预扩增和Cas13来检测RNA或DNA单基因。它可以检测登革热或寨卡病毒单链RNA以及患者液体活检标本中的突变。“使用CRISPR诊断检测COVID-19的方法”,已在网站上报道,为有兴趣进一步发展这一诊断系统的研究人员提供了一些参考,突出了它作为一个可倍增、便携、快速、定量的核酸检测平台的潜力

图3.使用Cas13检测RNA病毒的方案。 该图经Ref许可转载

6、总结与展望

当前,COVID-19的诊断主要依赖于冠状病毒RNA的检测。 选择适当的检测方法非常重要。然而,上述的每一种方法都有其独特的优点和不可避免的缺点。PCR技术被广泛应用于病毒鉴定,具有较高的敏感性和特异性,但它的分析需要各种设备和受过良好教育的分析员,而这只有在一个成熟的实验室才能完成。LAMP是一种超灵敏的核酸扩增方法,通常能在大约一小时内检测到少量的DNA或RNA模板,但对高温的要求限制了其适用性。对于基因芯片而言,其高昂的成本不可避免地限制了其在冠状病毒检测中的进一步应用。因此,今后仍有必要开发更有效、更实用的方法来克服现有方法的不足。

 

迄今为止,在改进冠状病毒检测方面已作出了相当大的努力,并开发了各种改进的或新的方法。在实际应用中,为了尽量避免使用单一方法的缺点,通常将几种方法结合起来。总之,随着新技术和新方法的迅速发展,我们相信未来将会有更多优秀和高效的检测方法发展,这将为科学家/临床医生提供更多的选择。同时,只有根据不同的检测目的,平衡各种检测方法的优缺点,才能得到最经济、最理想的选择。

 

原文出自:https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2095177920302082

Baidu
map