姜盛花(2002)利用18个微卫星DNA标记研究了8个中外猪群体遗传的多样性，在WZSP近交系中发现两个微卫星特异性等位基因，分别是微卫星座位SW936的85bp(基因频率为0.350)，微卫星座位S0070的264bp(基因频率为0.125)。为验证其是否是WZSP近交系特异的等位基因，以WZSP近交系110头及通城猪100头为材料，利用两个微卫星座位SW936及S0070来进一步确认 WZSP近交系微卫星特异性等位基因，分析了特异性等位基因所在的微卫星座位的遗传变异，并对 WZSP近交系特异性等位基因进行进一步的研究，探讨了利用此微卫星特异性等位基因作为种群鉴定的候选分子标记的可能性，为今后更好地开发利用WZSP近交系群体这一宝贵的种质资源奠定基础。

(一)材料和方法

WZSP近交系的耳组织样采自中国农业科学院畜牧研究所WZSP保种场，通城猪的血样采自于湖北省通城县畜牧局种猪场。2个微卫星座位(S0070、SW936)的引物由上海博亚生物技术有限公司合成，其序列为：

Forward Primer：SW936  5'TCTGGAGCTAGCATAAGTGCC  3'

Reverse Primer：SW936  5' GTGCAAGTACACATGCAGGG  3'

Forward Primer：S0070  5' GGCGAGCATTTCATTCACA  3'

Reverse Primer：S0070  5' GAGCAAACAGCATCGTGAGC  3'

按照常规方法进行DNA的提取、PCR扩增、电泳检测、克隆、测序测定及结果比较分析，其群体遗传多样性用POPGENE VERSION 1.31及PPAP 3.0软件包，进行统计数据及分析。

(二)结果及分析

1.电泳结果  比较WZSP近交系和通城猪的微卫星电泳分型结果，发现微卫星座位SW936在 WZSP近交系中具有特异性等位基因，大小为88bp。而在微卫星座位S0070上没有发现WZSP近交系所特有的等位基因。微卫星座位SW936、S0070在2个群体中的部分电泳结果如图1-33所示。

2.基因频率及克隆测序结果  WZSP近交系在微卫星座位SW936、S0070的等位基因及频率，与通城猪群体在微卫星座位SW936的固定指数(Fis，Fit，Fst)及均值分别如表1-32、表1-33所示。

克隆测序结果及比较如图1-34所示：

通过15％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，Fotodyne凝胶成像系统扫描，Gel Analyzer软件分析，在110头WZSP近交系中，有77个个体在微卫星座位SW936含88bp的等位基因，所占比例为70.9％。

(三)讨论

1.品种特异性等位基因的确定  在对WZSP近交系两个微卫星座位SW936，S0070上两个等位基因进行特异性确认的过程中，微卫星座位SW936上88bp大小的等位基因由于基因频率(0.5)较高，与其他等位基因片段大小差距较大，且在通城猪群体中进行验证时，可以很清楚地看出其对应片段大小区域没有发现此等位基因，因而在本研究中很容易地得到了确认。而在WZSP近交系(110头)中，本实验在微卫星座位S0070上所观察到的最小等位基因片段大小为270bp，没有发现264bp的等位基因。当然，在WZSP近交系特异性等位基因的确认过程中，可能存在一些不足，尽管所研究的每个品种的数量比较多(姜盛花2002年研究的8个品种，每个品种的数量都达到了50头以上，本次研究的通城猪群体为100头，但验证的品种数目不是特别多)。

为了进一步确认WZSP近交系特异性等位基因，使结果更具有严谨性。本研究对此特异性等位基因进行了克隆测序，结果为88bp，这与姜盛花(2002)的研究结果(85bp)基本相符。通过序列对比分析结果我们可以得知，和GeneBank上猪微卫星座位SW936的序列相比，WZSP近交系相应座位的特异性等位基因少11个重复单位[这11个重复单位(GT)在图1-34中用下划线表示]。GeneBank公布的微卫星座位SW936的序列长度范围为92～112bp，而本序列经15％的非变性聚丙烯酰胺检测、Gel Analyzer软件分析、最后克隆测序证实为88bp(图1-34)。因此，我们认为此特异性等位基因是微卫星座位SW936的一个新等位基因。这说明在已研究的群体中，在微卫星座位SW936都没有发现此88bp的等位基因，这给WZSP近交系在微卫星座位SW936上特异性等位基因的确认提供了有力的补充。

在基因组中，微卫星座位上各等位基因的突变频率各异，含较多重复单位的序列易发生突变，而含较少重复单位的序列发生突变的几率小，甚至在很多代不发生突变。微卫星座位上等位基因的高度相似性使人们提出了这样的假设：突变可能与复制过程中的滑动错配有关。研究显示，90％以上的突变是由于重复单位的增加或减少而引起的，突变频率为1.2×10的-4次方～1.5×10的-2次方。本次研究的对象WZSP近交系是由2头种猪(1公1母)通过高度近交的方式培育成的，目前已培育出17代(2005)。根据微卫星座位的突变频率范围(1.2×10的-4次方～1.5×10的-2次方)，经过17代近亲繁殖的WZSP近交系，其发生突变的概率基本上可以忽略不计。因此，认为WZSP近交系在微卫星座位SW936上的等位基因是它们的原始祖先(1公1母)所拥有的，并且世代相传。

另外，两群体在微卫星座位SW936的固定指数Fst均值为0.3014，比太湖猪类群(0.182)(樊斌，2002)及欧洲11个品种(0.27)(Laval等，2000)都大，这说明两群体在微卫星座位SW936的品种间分化程度很大。这个结果与两群体间存在较大的地理位置分布及繁殖方式方面的差异密切相关， WZSP原产于海南省五指山区，在北京异地保种并被成功育成近交系，而通城猪产于湖北省通城县且随机交配。结果初步表明，五指山小型猪是一个独特基因库，其诸多生物学特性以及分子遗传学特异性有待进一步深入研究和开发利用。

2.遗传疾病的预测  与人类疾病相关的微卫星序列，其长度在正常个体中有一定的阈值范围，重复单位的重复次数都有一个严格的上限，超过了这个上限，就会使它们处于一种前突变状态，使其后代的重复次数急剧上升，增加患病的几率。因此，可以从个体微卫星重复次数的多少来预测个体患病的风险，甚至可以预测个体可能发病的年龄。Maddox等(1994)在FragileX基因中证实，随着重复单位数目的增加，患亨廷病的风险也随之增大。冯书堂(1998)通过对五指山猪的生物学特性及遗传多样性研究发现，该品种具有很强的抗逆性，免疫力强，是进行猪胚胎工程研究的重要材料。而通过对其微卫星座位SW936上特异性等位基因的克隆测序结果又表明：与其他猪品种在相应座位的等位基因相比，它具有更少的重复次数。因此，我们初步推测WZSP的抗逆性、免疫力强可能与其微卫星特异性等位基因相关。

3.品系、种群鉴定  当前利用微卫星做种群鉴定的方法主要有最小距离法和最大似然法。用这两种方法，可以计算某个体属于某一种群的概率。Biornstad等(2000)对挪威马进行个体聚类研究，其结果显示当微卫星座位在20个时，使用最大似然法，准确率可达98％以上。杨述林(2004)利用27个微卫星DNA标记研究18个中国地方猪品种遗传多样性时发现：当选取最大似然法时，判别的准确率为98.45％～99.91％；而选取遗传距离法时，判别的准确率为96.82％～99.30％。用以上两种方法，都可以很好地对物种进行种群鉴定，但它们都存在所需微卫星DNA标记多、实验步骤繁琐等方面的缺点。在本实验中，由于所研究的群体是近交系，其微卫星座位上等位基因数量比非近交系群体要少得多。对于猪来说，一般群体微卫星座位上等位基因的数目为6～12个，而近交系却只有1～4个。结合微卫星座位SW936所含特异性等位基因是WZSP近交系最原始的等位基因且基因频率(0.5)最大的特点，探讨了直接利用WZSP近交系在微卫星座位SW936上的特异性等位基因作为分子标记进行种群鉴定的可能性，并根据110头WZSP近交系群体在微卫星座位SW936的电泳结果，统计出含有此特异性等位基因的个体在群体中所占的比例高达70.9％。因此，在WZSP近交系这一特异群体的种群鉴定中，认为此微卫星特异性等位基因具有重大意义，可以初步作为WZSP近交系种群鉴定的一个重要候选分子标记。已获得国家发明专利(ZL.200510008994.2)。