赛业神经科学云课堂第三期：寻找造成帕金森病的凶手，重现案发过程
赛业神经科学云课堂，不定期更新神经领域相关干货，同时欢迎大家提出自己感兴趣的神经方面的问题，我们将筛选大家感兴趣的问题，在本栏目后面的内容为大家做出详细解答～
4.11日是世界帕金森病日，为了让大家深入了解这个疾病，我们做了两期专题内容，上期给大家介绍了PD的症状、流行病学、诊断和主要的治疗方法，错过的同学可以戳这里回顾。这期内容，我们将带大家寻找造成帕金森病的凶手，重现案发过程。
01 导致PD的重要嫌疑人及案发现场
如果我们把帕金森病当作一起案件的话，那么案发地就是中脑黑质区（Substantia nigra，SN）；受害人就是多巴胺神经元，现在的目标就是找到“凶手”。
经过调查，一种神经细胞内聚集的蛋白质—路易小体（Lewy Body），多次出现在案发现场，而路易小体是由α-synuclein（α突触核蛋白）聚集而成的，所以我们是否可以将α突触核蛋白作为真凶呢？答案是不能，只能当成重要嫌疑人或者是犯罪成员之一，因为在部分PD病患的SN中，α突触核蛋白是有不在场证明的。
刚开始，案件就陷入了僵局。那么我们先来看看案发现场黑质区域，由于该区域中有富含神经黑色素（neuromelanin）的神经元聚集，颜色较深。该区域隶属于基地神经节（basal ganglia，BG）的一部分，而基地神经节又是中脑（Middle Brain）的子区域，无论是从人类还是啮齿类动物的大脑角度看，这个区域的体积都很小（注意，图中绿色部分代表的是整个中脑，而黑质只是其中箭头所指虚线附近部分），但对于动物的运动却至关重要。这是因为其中有大量的多巴胺神经元聚集，多巴胺的功能不用多说，除了是所谓的“快乐源泉”以外，也对人类的运动起着调节作用，过多和过少都不是好现象。SN虽然很小，但还是可以分成两个区域，黑质致密区（Substantia nigra pars compacta，SNc）和黑质网状区（Substantia nigra pars reticulata，SNr），其中致密区含有大量的多巴胺神经元，也是PD的重灾区。SNr区接收并处理BG和其他脑区的输入信号，SNc中的多巴胺神经元则负责根据SNr提供的信息向纹状体（striatum）提供多巴胺，进而调控运动。而PD则是因为前文提到的该区域多巴胺神经元死亡而造成的多巴胺分泌不足，导致丘脑参与控制的运动过程发生障碍。
图1. 中脑黑质是PD的病灶[1-4]
02 案情推测： 帕金森病的发病假说
我们先说一下造成多巴胺神经元死亡的重要嫌疑人“α-synuclein”，该蛋白由4号染色体上的SNCA基因（Synuclein Alpha）编码而来，在大脑中含量丰富，分布在神经元突触前膜上。正常情况下，这种蛋白规规矩矩地行使它日常朴实无华的功能（目前一些研究发现该蛋白参与突触囊泡的释放，但具体细节仍有待研究）。那么，这个平时没什么存在感的突触核蛋白又是怎么走向黑化之路的呢？首先，如果SNCA基因本身存在突变或者过多重复，会导致α-synuclein增多，加剧聚集；接下来，如果负责降解工作的parkin(泛素连接酶)和UCH-L1蛋白发生改变，那么，也会造成α-synuclein的累积；再然后如果HSPs1也发生改变的话，会导致α-synuclein与多巴胺结合，降低多巴胺水平；如果α-synuclein聚合物进一步合体形成路易小体，本身就具有神经毒性，而且抱团之后还能共同抵抗其他机制对其的降解。
除了泛素降解外，自噬作用也是神经元防止α-synuclein聚集的重要手段，LRRK2（和自噬作用有关的蛋白）的突变与家族早发型的PD相关。此外，因为自噬和PD搭上关系的还有Rab1A。ATP酶ATP13A2也是PD相关基因。
和AD一样，早发型PD遗传度较高，晚发型PD的遗传度非常低，但无论如何，咱也可以通过大量测序找到一些犯罪嫌疑人，比如在AD中大放异彩的MAPT就又被拎了出来，但这个需要在额颞叶痴呆并发PD中才有，其实是额颞叶痴呆的特征；另外APOE4也与PD的发病扯上了关系，而且APOE2这个具有AD保护作用的APOE形式也被指控提高了PD的发病率。
虽然在某种程度上，α-synuclein可以和AD中的Aβ进行类比，但其实这二者在PD和AD中的作用还是有很大区别的。首先，Aβ是在胞外聚集的，而α-synuclein是在胞内形成路易小体的，这有点类似于AD发病的帮凶tau；另一方面Aβ聚集可以说是AD的标志，如果没有淀粉样沉淀，这种痴呆就不属于AD，但路易小体只是PD大概率出现的病理特征，并不能作为PD诊断的必要条件。这是因为很多家族性的PD中并没有路易小体的形成，而家族性的AD中淀粉样蛋白沉淀则是必须的。
图2. 帕金森病的发病假说[5]
03 重现案发过程的”工具“—PD动物模型
帕金森病造模的主要目标就是尽量特异性杀死SNc中的多巴胺神经元，减少下游纹状体能够接收到的多巴胺。从方式上看主要有化学诱导和基因编辑两种。
化学诱导PD模型
化学诱导的模型的优点是：有明显的SNc多巴胺神经与减少和纹状体多巴胺缺失，部分药物也能诱导出路易小体；但是化学诱导的PD模型也有明显的缺点：那就是多巴胺神经元的死亡速度过快，人从多巴胺神经元死亡到PD发病一般都要经历十几年以上，而化学诱导的模型几天内就达到了人几十年病程形成的死亡的神经元数量，而且这些神经元和多巴胺缺失最严重的模型中，并没有路易小体的出现。个人认为路易小体的形成绝非一朝一夕之功，需要众多α-synuclein十几年甚至几十年的修炼。
MPTP是最早被应用于建立PD模型的化学毒性物质，但有意思的是MPTP对灵长类和（NHP）小鼠具有很强的毒性，但是对大鼠的毒力却不是很强。无论是在NHP还是小鼠实验中，MPTP都能造成严重的黑质神经元丢失和纹状体多巴胺减少，上述损伤是对PD这部分病理表型非常好的模拟。
另一种化学物质就是6-OHDA了，比起MPTP，这玩意儿能用来构建大鼠PD模型，但6-OHDA不能通过血脑屏障，因此大多数情况下需要直接向脑里进行注射。和MPTP一样，α-synuclein还没来得及聚集多巴胺神经元就挂了。
长时间使用rotenone可以使大鼠黑质纹状体多巴胺减少，还能产生多项类似人类PD中的症状，长时间使用rotenone还能诱使神经元产生有成为路易小体潜质的初始α突触核蛋白聚合物。但也有一些研究表示rotenone先前优秀的造模效果无法重复。
下面一个出场的就是著名的除草药物——百草枯了，作为曾经大范围应用的农药，现在已经因为会诱导帕金森而提早退休，但是仍然活跃在科研舞台。
此外，还有METH（methamphetamine）和MDMA（methylenedioxymethamphetamine）也是用于PD化学建模的物质，应用也比较广泛。
图3. 化学诱导PD模型[6]
PD相关基因编辑模型
人类家族性或者散发性PD相关基因的基因编辑动物是另一类值得研究的模型。人们最先想到的是α突触核蛋白转基因小鼠，所以对应基因也被叫做Park1（帕金森相关基因No.1）。家族性PD的Park1三个突变（A30P, A53T和E46K）和该基因的拷贝数异常增加（两倍或三倍）都是PD的罪魁祸首，针对上述PD病因制作的转基因小鼠已经大量应用于实验，一些表达人类突变α-synuclein的小鼠纹状体中多巴胺明显减少，有的品系有类似路易小体前体的包涵体出现，而且还出现了PD症状。不过美中不足的是，几乎所有针对α突触核蛋白的小鼠并没有发生明显的黑质神经元死亡。之所以没有把话说死，是因为有研究发现如果用Pitx3启动子转入α-synuclein，会发生多巴胺神经元渐进性死亡，但这个结果还需要更多的重复进行验证。此外，如果用病毒将突变的α突触核蛋白基因包装好，注射大鼠或者小鼠的脑中进行过表达，也可以造成PD的病理表型。
前文中已经提到的自噬相关LRRK2是晚发性PD相关基因，但是目前单独对这个基因进行操作的动物模型很难得到PD的明显表型。虽然LRRK2敲除小鼠不会产生路易小体，但在一定程度上造成α-synuclein的聚集，有部分品系还能出现运动障碍。遗憾的是，这些模型小鼠能产生路易小体的前体聚合物的没能出现运动障碍，而具有运动障碍的又没有路易小体前体产生。但该小鼠仍然在PD信号通路的研究中发挥了重要作用。
PINK1是另一个晚发AD相关基因，但如果在PINK1敲除小鼠的SNc中过表达突触核蛋白，就会造成该区域的多巴胺神经元大量死亡。另一方面如果直接将PINK1基因直接敲除，会造成纹状体的多巴胺减少，但不会造成多巴胺神经元死亡。E3连接酶PARKIN在小鼠中敲除后，除了部分小鼠有略微的多巴胺表达下降外，没有任何改变。不过最近又有一些不同的声音，经过一些稍微不同的基因编辑方法，有的模型动物的表型出现了一些改进。
DJ-1与早发型PD相关，但大部分经过改造的小鼠无法重现人类中的PD表型，不过在一种C57为背景的DJ-1敲除小鼠中，对它的描述是有明显的早发SNc区多巴胺神经元丢失，这种改变会随着年龄的增加而加剧，并会出现轻微的运动缺陷。如果小鼠的表型能够重复，这个品系也不失为PD研究中值得推广的模型。ATP13A2则是溶酶体相关的ATP酶，目前针对该基因的研究较少，但也是PD研究的潜力股。
虽然PD遗传风险相关的基因编辑小鼠整体的PD症状较轻，但人类PD的发病前相当长的一段时间内也是没有表性的，因此这类模型更像是对PD临床诊断前病患的模拟。因此，这些动物模型对我们的药物临床前研究依旧有着重要的意义。至于为什么这些基因编辑动物症状较轻，个人想法是小鼠因为寿命太短，没有充足的时间积累各种病理改变，因而无法产生人类中较严重的PD症状。
图4 . PD相关基因编辑模型[6]
总之，目前PD这个案件虽然已经抓到了不少“犯罪嫌疑人”，但由于缺少决定性的证据，至今仍然没有定案。目前PD动物模型中没有一款能百分之百完全模拟PD病症，但它们各有特点，对于推进PD的治疗和研究至关重要。化学毒性模型有最明显的多巴胺神经元凋亡，但非“自然”因素过强，毒性过大，路易小体产生困难；PD相关基因编辑小鼠内在与人的PD最为接近，也为我们提供了很多基因相互作用的信息，但由于物种的差异造成病理表型和行为表型不明显，而且不同的基因编辑方式和不同的检测方法也让实验结果常常不一致。
好了，关于PD的介绍就到这里，下一次给大家介绍由于霍金和冰桶挑战而家喻户晓的罕见病——渐冻症（ALS）！
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